FOXO6抑制SMURF2介导的NR4A1泛素化降解以促进糖尿病视网膜病变中视网膜色素上皮细胞铁死亡

《Journal of Cell Communication and Signaling》：FOXO6 inhibits SMURF2-mediated ubiquitination and degradation of NR4A1 to promote retinal pigment epithelial cell ferroptosis in diabetic retinopathy

　　

糖尿病视网膜病变（DR）是视力丧失的主要原因，其中视网膜色素上皮（RPE）细胞功能障碍是关键因素。铁死亡（ferroptosis）与高血糖下的RPE损伤有关，但其上游调控机制仍不清楚。研究人员使用了高糖（HG）诱导的人RPE ARPE-19细胞和糖尿病小鼠模型。通过生化检测、Western blot、荧光探针和组织学染色评估了铁死亡。使用免疫共沉淀（Co-IP）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）pull-down、染色质免疫沉淀（ChIP）和荧光素酶报告基因检测法检测了蛋白质相互作用和转录调控。免疫荧光染色用于检测视网膜组织中的关键指标表达。核受体4A1（NR4A1）在HG诱导的ARPE-19细胞中表达上调。NR4A1敲低缓解了HG诱导的铁积累、脂质过氧化和铁死亡标志物变化。机制上，SMAD特异性E3泛素蛋白连接酶2（SMURF2）与NR4A1相互作用并促进其泛素化和降解。叉头框蛋白O6（FOXO6）被HG上调，并抑制SMURF2转录。SMURF2过表达减轻了HG诱导的ARPE-19铁死亡和DR小鼠的视网膜损伤，而NR4A1共过表达逆转了这一效应。SMURF2敲低逆转了FOXO6敲低对HG诱导的ARPE-19细胞铁死亡和DR小鼠视网膜损伤的影响。FOXO6–SMURF2–NR4A1轴在DR期间关键调控RPE细胞中的铁死亡。

糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病常见的微血管并发症，导致约35%的糖尿病患者出现视力丧失，而视网膜色素上皮（RPE）细胞功能障碍是其关键致病因素。铁死亡（ferroptosis）作为一种铁依赖、脂质过氧化介导的调节性细胞死亡方式，已被证实参与高血糖诱导的RPE损伤，但其上游调控机制尚不明确。核受体4A1（NR4A1）、SMAD特异性E3泛素蛋白连接酶2（SMURF2）和叉头框蛋白O6（FOXO6）在DR中的功能及其相互关系有待阐明。基于此，研究人员旨在揭示FOXO6–SMURF2–NR4A1轴调控RPE细胞铁死亡的分子机制，为DR治疗提供新靶点。该研究发表于《Journal of Cell Communication and Signaling》。

研究人员主要采用的技术方法包括：高糖（HG）处理人RPE ARPE-19细胞系（来源于ATCC）和C57BL/6小鼠糖尿病模型（高脂饮食联合链脲佐菌素诱导）；通过shRNA进行基因敲低，通过质粒过表达；利用Western blot、qPCR检测蛋白和mRNA表达；使用CCK-8检测细胞活力；采用生化试剂盒检测铁离子（Fe²⁺）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水平；运用FerroOrange荧光探针和C11-BODIPY^581/591流式分析评估铁积累和脂质过氧化；通过免疫共沉淀（Co-IP）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）pull-down验证蛋白互作；通过染色质免疫沉淀（ChIP）和双荧光素酶报告基因检测转录调控；采用免疫荧光染色和H&E染色观察视网膜组织病理变化。

研究结果如下：

**3.1 NR4A1 knockdown attenuated high glucose-induced ferroptosis in retinal pigment epithelial cells**
通过Western blot证实HG处理上调ARPE-19细胞中NR4A1蛋白水平。使用shRNA敲低NR4A1后，CCK-8显示细胞活力恢复；生化检测和荧光探针表明铁积累、MDA水平降低，SOD活性升高；流式分析显示脂质过氧化减少；Western blot显示铁死亡抑制蛋白GPX4和SLC7A11上调，促铁死亡酶ACSL4下调。结论：NR4A1促进HG诱导的RPE细胞铁死亡。

**3.2 SMURF2 facilitated the ubiquitin-mediated degradation of NR4A1 in retinal pigment epithelial cells**
放线菌酮（CHX）追踪实验显示HG条件下NR4A1稳定性增加；Co-IP检测到HG降低NR4A1泛素化水平。通过BioGRID数据库筛选，Co-IP和GST pull-down证实SMURF2与NR4A1直接相互作用，而OTUB1/OTUB2无互作。Western blot显示HG抑制SMURF2表达。SMURF2敲低延长NR4A1半衰期并降低其泛素化，过表达则相反。结论：SMURF2促进NR4A1泛素化降解。

**3.3 Overexpression of NR4A1 reversed the protective effect of SMURF2 overexpression against high glucose-induced ferroptosis in retinal pigment epithelial cells**
在ARPE-19细胞中，SMURF2过表达降低NR4A1蛋白水平，提高细胞活力，减少铁积累、MDA和脂质过氧化，恢复SOD活性，并上调GPX4/SLC7A11、下调ACSL4；而NR4A1共过表达逆转上述所有效应。结论：NR4A1功能性拮抗SMURF2对铁死亡的保护作用。

**3.4 NR4A1 overexpression attenuated the effect of SMURF2 overexpression on ferroptosis in the retina of diabetic mice**
糖尿病小鼠视网膜中SMURF2降低、NR4A1升高。玻璃体腔注射慢病毒过表达SMURF2后，体重和血糖改善，视网膜结构及RPE细胞数保存，MDA降低、SOD升高，铁死亡相关蛋白恢复正常；而NR4A1共过表达取消这些保护作用。结论：体内NR4A1介导SMURF2对铁死亡的调控。

**3.5 FOXO6 transcriptionally repressed SMURF2 expression in retinal pigment epithelial cells**
JASPAR数据库预测SMURF2启动子含两个FOXO6结合位点；ChIP证实FOXO6结合。双荧光素酶报告显示FOXO6敲低增强SMURF2启动子活性，突变结合位点后效应消失。qPCR和Western blot显示FOXO6敲低上调SMURF2表达。HG条件下FOXO6升高、SMURF2降低，FOXO6敲低逆转此变化。Co-IP未检测到SMURF2与FOXO6互作。结论：FOXO6直接转录抑制SMURF2。

**3.6 SMURF2 knockdown reversed the protective effect of FOXO6 knockdown against high glucose-induced ferroptosis in retinal pigment epithelial cells**
在HG处理的ARPE-19细胞中，FOXO6敲低上调SMURF2，增加细胞活力，减少铁积累、MDA和脂质过氧化，恢复SOD活性，并上调GPX4/SLC7A11、下调ACSL4；而SMURF2共敲低逆转上述所有效应。结论：SMURF2是FOXO6调控铁死亡的下游效应分子。

**3.7 SMURF2 knockdown reversed the inhibitory effect of FOXO6 knockdown against ferroptosis in diabetic mouse retinas**
糖尿病小鼠视网膜中FOXO6升高。FOXO6敲低改善体重和血糖，恢复SMURF2表达，降低NR4A1水平，保护视网膜结构和RPE细胞，降低MDA、升高SOD，并调节铁死亡相关蛋白；而SMURF2共敲低部分逆转这些保护作用。结论：体内FOXO6通过抑制SMURF2促进铁死亡。

讨论部分指出，DR中高血糖诱导RPE细胞铁死亡，而FOXO6–SMURF2–NR4A1轴是关键的调控通路。NR4A1作为促铁死亡因子，其稳定性受SMURF2介导的泛素化降解调控；FOXO6通过转录抑制SMURF2导致NR4A1积累。该研究明确了SMURF2作为潜在治疗靶点的价值，但存在局限性，如仅使用小鼠模型和ARPE-19细胞系，需在原发性人RPE细胞中验证，且该轴是否也参与氧化应激和凋亡有待进一步研究。

研究结论翻译：总之，本研究确定了一个新的调控轴，其中FOXO6转录抑制SMURF2，导致NR4A1泛素化和降解减少，从而促进糖尿病条件下RPE细胞铁死亡。这些发现推进了研究人员对DR中铁死亡调控的理解，并提示SMURF2可能是限制NR4A1积累和调节铁死亡信号的治疗靶点。