基于无标签EQ8–SclF融合蛋白的马腺疫间接ELISA的开发与评估

《Veterinary Sciences》：Development and Evaluation of an Indirect ELISA for Strangles Based on an Untagged EQ8–SclF Fusion Protein

马腺疫由马链球菌马亚种引起，是一种高度传染性的呼吸道疾病，给全球马业造成巨大的经济损失。目前的血清学诊断主要依赖进口的IDvet?双抗原夹心ELISA(酶联免疫吸附测定)试剂盒，该试剂盒显示出良好的诊断性能，但价格昂贵且在中国缺乏国产替代品，从而限制了其在基层兽医机构中的常规使用。研究人员的目的是开发一种基于新型抗原靶标和无标签抗原纯化策略的国产间接ELISA。通过比较生物信息学分析，鉴定出两个对S. equi具有种级特异性的保守片段，分别命名为EQ8(150 aa)和SclF(44 aa)，并进行了融合重组表达。通过GST亲和层析纯化融合蛋白，用PreScission蛋白酶切割，并进行二次纯化以获得无标签的EQ8–SclF蛋白。Western blotting(蛋白质印迹法)和ELISA表明，纯化的蛋白保留了良好的免疫反应性，并且GST标签未引起可检测到的交叉反应性，使用GST包被板获得的所有OD₄₅₀值均保持在0.09以下，远低于0.115的临界值。棋盘式滴定确定了最佳检测条件为1 μg/mL的抗原包被浓度和1:100的血清稀释度。使用IDvet试剂盒作为参考方法，平行测试了157份临床血清样本（67份阳性，90份阴性）。新开发的检测方法显示出89.55% (60/67)的相对敏感性、94.44% (85/90)的相对特异性、92.36% (145/157)的总体符合率和0.84的kappa值，表明两种方法之间具有极好的一致性。观察到良好的批间重现性，变异系数(CV)均低于9.29%。总之，基于无标签EQ8–SclF融合蛋白的间接ELISA初步建立用于马腺疫的血清学检测。该检测方法显示出与进口商业试剂盒高度一致的诊断性能，同时在较低成本、更简便操作和消除标签相关干扰方面具有潜在优势。因此，它显示出作为马腺疫血清学诊断国产替代品的潜力。

马腺疫由马链球菌马亚种引起，是一种高度传染性的呼吸道疾病，对马匹健康构成重大威胁，并给全球马业造成巨大的经济损失。由于病原体广泛分布且具有极强的环境持久性，加上约10%的康复马匹成为无症状携带者，病原体可在咽囊中持续存在并间歇性排毒，导致疾病控制极具挑战性，疾病根除受阻。因此，能够检测既往感染诱导抗体的血清学方法在监测和疾病控制中具有重要价值。在现有的诊断方法中，实时定量聚合酶链反应虽然对病原体检测具有高敏感性，但无法区分死菌与活菌，且严重依赖适当的样本采集，限制了其在大规模筛查中的应用。酶联免疫吸附测定操作简便且适合高通量筛查，但其准确性关键取决于抗原特异性。基于单一SeM抗原的间接ELISA与马链球菌兽疫亚种的SzM蛋白存在交叉反应，导致特异性仅为约77%，假阳性率过高。Robinson et al.开发了针对抗原A和抗原C(SeM)的双抗原间接ELISA，将特异性提高至99.3%。基于此原理，法国IDvet公司开发了马腺疫双抗原夹心ELISA试剂盒作为参考方法。然而，该试剂盒依赖进口且成本较高，限制了其在中国的广泛使用，特别是在基层兽医环境中。因此，开发具有同等性能和较低成本的国产替代方案具有现实意义。研究人员开展了基于新型抗原靶标和无标签抗原纯化策略的国产间接ELISA开发研究，并在《Veterinary Sciences》上发表。研究结论表明，所建立的检测方法在诊断性能上与进口商品化试剂盒高度一致，在成本和操作上具有潜在优势，为马腺疫的血清学诊断提供了国产替代方案，具有重要的公共卫生和经济意义。

研究人员主要运用了比较生物信息学分析、基因克隆与重组表达技术、蛋白质纯化与免疫印迹技术以及间接ELISA方法建立与优化等技术方法。通过SnapGene和Geneious Prime软件对马链球菌马亚种和马链球菌兽疫亚种的相关序列进行比对，筛选特异性抗原片段。利用同源重组技术构建重组质粒，并在大肠杆菌中表达。通过GST亲和层析和PreScission蛋白酶酶切进行二次纯化以获取无标签蛋白。采用棋盘式滴定优化ELISA反应条件，并使用蛋白质印迹法验证蛋白免疫反应性。在方法评估中，样本队列来源于2023至2024年间从中国哈尔滨及周边地区采集的157份无疫苗接种史的马血清样本，并根据IDvet试剂盒结果分为67份阳性和90份阴性。

3.1. 种级抗原片段的鉴定
通过比较生物信息学分析，研究人员成功鉴定出EQ8(150 aa)和SclF(44 aa)片段。这两个片段在马链球菌马亚种参考菌株中具有良好保守性。其中，SclF片段在马链球菌兽疫亚种的相应区域缺失，而EQ8片段与马链球菌兽疫亚种序列同源性低。两者均具备种级特异性，可作为特异性诊断试剂的分子靶标。

3.2. 重组质粒的构建与验证
通过基因克隆技术构建了重组质粒pGEX-6p-1-EQ8–SclF。利用马链球菌马亚种基因组DNA作为模板，聚合酶链反应(PCR)扩增获得了预期大小的EQ8和SclF片段。双酶切验证结果显示释放的插入片段大小约为618 bp，与包含柔性接头的EQ8–SclF融合基因预期大小完全一致，测序进一步确认插入序列正确，表明重组质粒构建成功。

3.3. 重组蛋白的表达、纯化与鉴定
在优化条件下表达融合蛋白，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和GST亲和层析纯化获得了高纯度产物。经PreScission蛋白酶酶切和二次纯化后，成功获得了高度纯化的无标签EQ8–SclF蛋白。蛋白质印迹法证实，纯化的蛋白保留了强免疫反应性，阳性马血清能特异性识别其抗原表位，且最终产物不含GST标签，无标签相关干扰，适用于后续ELISA开发。

3.4. 间接ELISA的优化条件及其诊断性能
经棋盘式滴定确定最佳抗原包被浓度为1 μg/mL，血清稀释度为1:100，此时阳性与阴性比值最高。以18份已知阴性血清计算得出临界值为0.11554，对应99.9%的置信水平。特异性测试表明该检测方法对其他马匹病原体阳性血清无交叉反应，且GST蛋白作为包被抗原测试时OD₄₅₀值均低于临界值。批间重现性测试的变异系数(CV)均低于10%，表现出良好的重现性。

3.5. 间接ELISA的性能评估
研究人员将新建立的ELISA与IDvet试剂盒进行了平行测试。结果显示，新方法与参考试剂盒的总体符合率为92.36% (145/157)，kappa值为0.84，相对敏感性为89.55% (60/67)，相对特异性为94.44% (85/90)。一致性散点图显示大部分样本聚集在真阴性和真阳性象限，表明新方法与商业参考试剂盒的诊断性能高度一致。

3.6. 与商业IDvet试剂盒的比较
通过对新建立的ELISA与IDvet试剂盒进行157份临床血清样本的平行测试，结果显示新ELISA的总体符合率为92.36% (145/157)，kappa值为0.84，表明两种方法具有极好的一致性。相对敏感性和相对特异性分别为89.55%和94.44%。一致性散点图显示大部分样本聚集在真阴性和真阳性象限，仅有少量不一致的样本分布在假阳性和假阴性象限，进一步证实新建立的ELISA具有与商业参考试剂盒高度一致的诊断性能。

在讨论部分，研究人员指出马腺疫血清学诊断的核心挑战在于不损害诊断特异性的前提下实现广泛可及性和实用性。现有商品化IDvet试剂盒虽性能稳定，但成本高且依赖进口；早期基于单一抗原的方法因交叉反应导致特异性不足。本研究未采用常规抗原设计，而是筛选了种级特异性片段EQ8和SclF，并通过无标签纯化策略消除了纯化标签可能引起的非特异性背景，提高了检测特异性。部分样本出现的不一致结果可能与不同抗原诱导的抗体动力学差异有关，但需进一步验证。研究承认目前以商业试剂盒为参考标准而非病原学金标准，且用于确定临界值的阴性血清样本量相对较小，未来需引入qPCR和细菌培养进行评估并扩大样本量。此外，由于本研究使用的靶标不同于现有疫苗和诊断试剂盒，还可能具备区分感染与免疫动物(DIVA)的潜力。最后，结论部分指出，研究通过种级抗原筛选和无标签融合蛋白的制备，初步建立了一种马腺疫间接ELISA。该方法与商业IDvet试剂盒具有高一致性，总体符合率为92.36%，kappa值为0.84，相对敏感性为89.55%，相对特异性为94.44%，且批间重现性良好(CV < 10%)。本研究验证了从抗原筛选到蛋白制备的整合技术路线，为开发国产诊断试剂提供了潜在的技术参考。