《Journal of Immunological Methods》：Antibody-pair based immunochromatographic sensor for analytical development and onsite monitoring of chromium contamination
编辑推荐：
•饮用水源中的有毒杂质威胁着人类和环境，引起了全球关注。•用于检测金属离子的基于抗体的免疫检测方法需求量大。•针对特定靶标的单克隆抗体（MAb）和多克隆抗体（PAb），通过夹心ELISA进行优化和验证。•整合抗体对开发免疫层析检测（ICT）传感器，用于快速、现场检测和水源的常
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饮用水源中的有毒杂质威胁着人类和环境，引起了全球关注。
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用于检测金属离子的基于抗体的免疫检测方法需求量大。
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针对特定靶标的单克隆抗体（MAb）和多克隆抗体（PAb），通过夹心ELISA进行优化和验证。
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整合抗体对开发免疫层析检测（ICT）传感器，用于快速、现场检测和水源的常规监测铬污染。
引言
铬被认为是对环境（包括水、土壤和空气）产生有害影响的金属之一（Saha et al., 2011; Ibikunle et al., 2025）。在所有氧化态中，六价铬（Cr(VI)）被认为是高风险的环境污染物（Teweldebrihan and Dinka, 2025）。通过工业废水排放到附近的河流、运河和水库中的此类污染物的广泛排放，加速了铬离子向自然环境的释放（Naz et al., 2016; Smith, 2008）。由于其高溶解度，此类污染物正在侵入可利用的地下水和地表水水源。随后，通过饮用受污染的水，它侵入人体系统，引发严重的健康风险（Chen et al., 2019; Xie, 2024）。当这种有毒金属进入细胞并改变为三价形式[Cr(III)]时，氧化态的变化促进了细胞内活性氧（ROS）的过度产生，导致细胞标签紊乱，如线粒体功能障碍、血细胞DNA损伤、染色体异常和致癌风险增加（Beaumont et al., 2008; Kapoor et al., 2022; Georgaki et al., 2023）。根据对该重金属毒性水平的研究，世界卫生组织（WHO）建议饮用水中六价铬（Cr(VI)）的可接受浓度为0.05 mg/L（WHO, 2020）。
尽管有如此严格的规定，铬污染的发生仍然是全球采矿活动过度地区的主要环境威胁（Shadreck and Mugadza, 2013; Nayak et al., 2020）。据报道，在许多地区，普通民众通过饮用水摄入的铬含量超过了允许限制（Das et al., 2013; Dhakate et al., 2008）。鉴于严重的环境污染和长期的人类暴露，可靠检测方法的开发和各类水源中铬离子的系统性监测需求尤为突出。
不同的标准程序和基于实验室的实验方法，如二苯卡巴肼比色分析方法，光谱方法如原子吸收光谱法（AAS）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）、石墨炉原子吸收光谱法（GFAAS）和火焰原子吸收光谱法（FAAS）等，被广泛用于水样品中铬的检测（Blake et al., 2001; Sarada et al., 2008）。尽管如此，这些方法存在各种缺点，如耗时、需要熟练的操作人员、高质量设备和精确的实验室设置（Dutta and Ghosh, 2013; Giri and Singh, 2015; Nayak and Das, 2014）。由于这一限制，水样的快速分析具有挑战性。
近年来，许多基于免疫分析的检测方法被认为是快速、特异性、可行和现场监测环境污染物的有效选择。已制定基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的方法检测不同的重金属，如镉[Cd(II)]、甲基汞(MeHg)、铅[Pb(II)]、铬[Cr(III)]，但它们都基于间接ELISA、直接ELISA和竞争性ELISA方法，使用单一抗体。然而，这些方法容易出现交叉反应，信号灵敏度较低（Ling et al., 2021; Jones et al., 2002; Ho et al., 2010）。
与其他ELISA方法如直接、间接和竞争性ELISA相比，夹心ELISA被认为是最可靠的选择，因为它使用两种抗体针对单一抗原的不同表位（Dixit et al., 2010; Zhou et al., 2009）。双表位识别机制通过大大提高检测灵敏度，使该方法区别于其他ELISA方法。该方法还通过限制非靶标成分与两种抗体（捕获抗体和检测抗体）的结合来执行靶标选择性。该策略显著降低了假阳性结果的可能性。该方法的信号响应非常高，即使在低基质供应的情况下也能更有效地检测金属浓度。夹心ELISA被认为是一种理想的方法，因为它具有增强的特异性和无与伦比的灵敏度，尽管需要精确验证的表位兼容抗体。
在本研究中，开发了一种基于新型抗体对的免疫层析（ICT）检测方法，用于快速和现场检测水中的三价铬离子（Cr(III)）。初步程序包括使用夹心ELISA方法筛选和优化适当的抗体对（单克隆抗体（MAb）和多克隆抗体（PAb）），随后用于ICT检测设计。MAb的特异性与PAb的广泛反应性相结合，将确保检测方法具有稳健和增强的信号灵敏度。该方法使用Cr(III)-EDTA-BSA金属偶联物进行优化。对所开发方法的总体性能和交叉反应性进行了彻底检查。对Sukinda地区的水样进行了测试，以确定检测准确性，并与标准ICP-MS测量进行比较验证。迄今为止，这是唯一一项关于开发基于抗体对的免疫层析传感器的研究报告，该传感器能在较少的时间和精力内实现铬的精确和现场检测。该工具的成功推广和应用可能会对环境和社区健康产生重要影响，特别是在铬污染地区。
各章节摘要
化学试剂
氯化铬离子（CrCl3）、Fe(II)、Cd(II)、Cu(II)、Co(II)、Mg(II)、Pb(II)、Zn(II)、Cu(II)、Pb(II)、牛血清白蛋白（BSA）、异硫氰基苄基乙二胺四乙酸（iEDTA）、DMSO（二甲基亚砜）、盐酸（HCl）、氯化钠（NaCl）均购自HiMedia Laboratories（HiMedia Laboratories Pvt. Ltd., B/4–6, M.I.D.C., Dindori, Nashik, 印度）。三乙胺购自SRL Pvt. Ltd.（Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., 马哈拉施特拉邦, 印度），
金属抗原（Cr-EDTA-BSA）的表征
为了制备抗原偶联物，金属通过与螯合剂（EDTA）的结合与载体蛋白即BSA结合。铬（CrCl3）、EDTA和BSA以0.33 mg/ml的浓度按1:1:1的比例使用，这被认为是制备稳定偶联物的最佳偶联浓度。
通过SDS-PAGE分析金属抗原偶联物（Cr-EDTA-BSA）
通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析金属抗原偶联物（Cr-EDTA-BSA），以确认铬的成功偶联。
结论
重金属导致的患病率和死亡率需要战略性地应对这一日益严重的现象。鉴于这种情况，本研究开发了一种铬监测工具，以减轻铬污染和侵入生物系统的后果。监测的主要步骤是检测铬，这相当棘手。因此，合成了金属抗原（CrCl3-EDTA-BSA）并进行免疫，以开发针对它的抗体（抗铬单克隆抗体
CRediT作者贡献声明
Subhadarsini Mohanty：撰写——审阅与编辑，撰写——原稿，可视化，方法论，形式化分析。Shikha Singh：撰写——审阅与编辑，验证，监督，资源，项目管理，概念化。K. Gopinath Achary：撰写——审阅与编辑，验证，资源，调查，形式化分析。
动物伦理声明
包括动物（小鼠）在抗体生产中的研究工作是在Imgenex India Pvt. Ltd.（E-5, Infocity, KIIT Post Office, Bhubaneswar, 奥里萨邦）进行的。因此，所有研究伦理和法规均按照Imgenex India Pvt. Ltd.机构动物伦理委员会的所有指南获得批准，该组织的动物设施已获得CPCSEA（动物实验控制与监督委员会，参考号
资助
本研究工作得到了Savitribai Jyotirao Phule单身女孩奖学金、大学拨款委员会的支持，奖项编号：F. No. 82–7/2022(SA-III)。
利益冲突声明
本手稿的作者声明，他们在发表此文章方面不存在利益冲突。
致谢
所有作者感谢Rama Devi女子大学、K. Gopinath Achary博士以及Imgenex India Pvt. Ltd.（E-5, Infocity, KIIT Post Office, Bhubaneswar, 奥里萨邦）和SignBio India Pvt. Ltd.（Daruthenga Road, Bhubaneswar- 751024, 奥里萨邦, 印度）的所有成员提供了进行本研究的所有设施。
Subhadarsini Mohanty | Shikha Singh | K. Gopinath Achary
