负载齐墩果酸与亚洲酸的固体脂质纳米粒的抗糖尿病及细胞毒性作用与计算机模拟评价

《Discover Pharmaceutical Sciences》：Antidiabetic and cytotoxic effects of solid lipid nanoparticles loaded with oleanolic acid and asiatic acid and in silico evaluation

　　

本研究评估了负载齐墩果酸(OA)与亚洲酸(AA)的固体脂质纳米粒(SLNs)相较于其游离化合物的抗糖尿病及细胞毒性效应。采用标准方案进行α-淀粉酶抑制试验，并在间歇性及非禁食条件下，使用Accu-Chek Active血糖仪评估HepG2细胞中的葡萄糖定量。利用MTT法在HepG2、HEK293及Caco-2细胞系上评估细胞毒性。研究人员将OA和AA对接至α-淀粉酶受体3BAJ和α-葡萄糖苷酶受体5NN8的活性位点。蛋白质使用Schr?dinger套件中的Protein Preparation Wizard和LigPrep模块进行制备，并采用OPLS4力场。对接采用标准精度(SP)和额外精度(XP)方法进行，结合自由能通过MMGBSA方法计算。OA、AA、阿卡波糖及未结合(APO)蛋白的复合物使用Schr?dinger套件中的system builder包进行溶剂化处理。负载OA和AA的SLNs及其游离化合物均显示出α-淀粉酶抑制特性，SLN制剂与其游离化合物之间无显著差异(P>0.05)。OA的IC₅₀值为39.41 μM，OA-loaded SLNs为42.26 μM，阿卡波糖为17.81 μM。相比之下，AA的IC₅₀值为143.85，AA-loaded SLNs为112.75，阿卡波糖为30.21 μM。HGMet、OA25、OA-SLNs25、OA50、OA-SLNs50及AA-SLNs50处理降低了处理培养基中的葡萄糖浓度(P<0.05)。同样，在HGMet-IF、OA-IF25、OA-SLNs-IF25、AA-IF25、OA-IF50、OA-SLNs-IF50、AA-IF50及AA-SLNs-IF50处理组中，培养基中的葡萄糖水平显著降低(P<0.05)。负载OA和AA的SLNs及其游离化合物在HepG2、HEK293和Caco-2细胞系中表现出极少或几乎无毒性。分子对接评分显示，OA对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的结合亲和力弱于AA，其中阿卡波糖的结合亲和力最强。所有蛋白质-配体复合物均保持稳定，RMSD值低于2.0 ?且RMSF值相对较低。负载OA和AA的SLNs及其游离化合物显示出α-淀粉酶抑制潜力并降低了处理培养基中的葡萄糖浓度，表明其可改善葡萄糖摄取且具有低细胞毒性。这些结果支持负载OA和AA的SLNs具有抗糖尿病特性，并强调需要进一步评估其有效性和安全性。

论文解读：负载齐墩果酸与亚洲酸的固体脂质纳米粒的抗糖尿病及细胞毒性作用与计算机模拟评价

一、研究背景与目的

糖尿病 mellitus (DM) 是一种以胰岛素缺乏或机体无法有效利用所分泌胰岛素为特征的代谢性非传染性疾病。据国际糖尿病联盟 (IDF) 统计，2021年全球约有5.37亿成年人罹患糖尿病，预计到2030年将增至6.43亿，到2045年将达7.83亿。其中，2型糖尿病 (T2DM) 约占所有糖尿病病例的90%-95%，以胰岛素抵抗和血脂异常为高发特征。长期 uncontrolled 的高血糖会渐进性损害血管和神经，导致肾病、视网膜病变和神经病变等多种并发症。虽然磺脲类等合成抗糖尿病药物及二甲双胍在临床上广泛应用，但伴随的体重增加、低血糖、乳酸酸中毒及胃肠道不适等副作用，加之长期依从性差，促使科研人员不断寻找更安全有效的天然来源的抗糖尿病制剂。

齐墩果酸 (oleanolic acid, OA) 和亚洲酸 (asiatic acid, AA) 是两种天然存在的脂溶性五环三萜类化合物，已报道具有抗氧化、抗糖尿病及抗炎等多种生物活性。它们可通过抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶等碳水化合物消化酶来降低餐后血糖。然而，这两种化合物极差的水溶性和由此导致的低口服生物利用度严重限制了其临床应用。固体脂质纳米粒 (solid lipid nanoparticles, SLNs) 作为一种以生理脂质和适宜表面活性剂为基质的新型药物递送系统，具有缓释药物、提高包封率、改善生物利用度、易于放大生产等优势，被视为改善亲脂性化合物溶解度的有效策略。但是，关于将OA和AA负载于SLNs后其抗糖尿病活性（α-淀粉酶抑制、葡萄糖定量）及细胞毒性与游离化合物相比是否有所提升，目前尚缺乏系统的实验证据。

二、研究内容与技术方法

本研究旨在实验层面比较负载OA和AA的SLNs与其游离化合物在α-淀粉酶抑制活性、不同条件（间歇性禁食IF与非禁食NF）下HepG2细胞葡萄糖定量以及HepG2、HEK293、Caco-2细胞系细胞毒性方面的差异，并通过分子对接和分子动力学模拟探讨两种化合物与α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶相互作用的分子基础。研究采用的主要关键技术方法包括：乳剂溶剂蒸发法制备OA-和AA-loaded SLNs；MTT比色法评估细胞活力；标准显色法检测α-淀粉酶抑制活性；Accu-Chek Active血糖仪间接定量处理培养基中剩余葡萄糖水平；使用Schr?dinger软件套件（Protein Preparation Wizard, LigPrep模块, OPLS4力场）进行标准精度(SP)与额外精度(XP)分子对接及MMGBSA结合自由能计算；利用System Builder包进行100 ns分子动力学模拟以分析复合物的RMSD和RMSF。细胞系购自南非Highveld Biological公司。

三、主要研究结果

1. α-淀粉酶抑制活性：通过不同浓度梯度（12.5-200.0 μg/mL）的酶抑制实验，研究人员发现OA和OA-loaded SLNs的半抑制浓度(IC₅₀)分别为39.41 μM和42.26 μM，二者抑制活性相当且无显著差异(P>0.05)；AA-负载SLNs的IC₅₀ (112.75 μM) 优于游离AA (143.85 μM)，但同样无统计学显著差异。阿卡波糖作为阳性对照其IC₅₀值最小。结果表明将AA包载于SLNs可在一定程度改善其酶抑制效能。

2. 细胞毒性评估：采用MTT法在三种细胞系上进行毒性检验，结果显示所有处理组（浓度最高达100 μg/mL）的细胞活力均保持在与未处理对照组相当的高水平（>85%），且细胞毒性不呈现浓度依赖性。统计分析表明，无论是OA-loaded SLNs与游离OA，还是AA-loaded SLNs与游离AA，其细胞活力均无显著差异(P>0.05)，证实SLN包载策略未损害细胞活力，具有良好生物相容性。

3. 葡萄糖定量分析：在非禁食(NF)条件下，与高糖对照组相比，HGMet、OA25、OA-SLNs25、OA50、OA-SLNs50和AA-SLNs50处理均可显著降低培养基中残余葡萄糖水平(P<0.05)，提示细胞对葡萄糖的摄取利用增强。其中OA-SLNs50处理组降糖效果优于游离OA50组。在间歇性禁食(IF)条件下，HGMet-IF、OA-IF25、OA-SLNs-IF25、AA-IF25、OA-IF50、OA-SLNs-IF50、AA-IF50和AA-SLNs-IF50均显著降低葡萄糖浓度(P<0.05)，且OA和OA-SLNs处理的降糖效应呈浓度依赖性，较高浓度（50 μg/mL）的效果更显著。

4. 分子对接分析：在α-淀粉酶受体(3BAJ)和α-葡萄糖苷酶受体(5NN8)活性位点的对接研究表明，阿卡波糖表现出最强的结合亲和力（α-淀粉酶SP评分为-6.602 kcal/mol，α-葡萄糖苷酶SP评分为-5.723 kcal/mol）。AA与OA的对接评分较阿卡波糖弱，其中OA与两种受体的结合能力均弱于AA。MMGBSA计算显示AA与α-淀粉酶的结合自由能(-30.69 kcal/mol)优于OA (-12.21 kcal/mol)。相互作用分析显示，AA主要通过羟基与α-淀粉酶的HIE299、ASP300、ASH197及α-葡萄糖苷酶的ASN524、ARG281形成氢键作用；OA则与ASP300形成氢键，在α-葡萄糖苷酶活性位点未观察到可见相互作用；阿卡波糖与两种酶形成了广泛的氢键网络。

5. 分子动力学模拟：对α-淀粉酶复合物进行100 ns模拟，所有体系（未结合蛋白APO、AA、OA及阿卡波糖复合物）的平均RMSD值均低于2.0 ?（分别为1.31、1.28、1.31和1.17 ?），RMSF值也处于较低水平（分别为0.745、0.707、0.694和0.689 ?）。相较于未结合蛋白，配体结合后体系的柔韧性降低，表明形成了稳定的蛋白质-配体相互作用，复合物稳定性顺序为阿卡波糖>OA>AA>APO。

四、结论与意义

本研究首次系统评估了负载OA和AA的SLNs在体外和计算机模拟层面的抗糖尿病潜力，证实了将这两种脂溶性三萜类化合物包载于SLNs后，不仅保留了与游离化合物相当的α-淀粉酶抑制活性和低细胞毒性特征，还可在一定程度改善其葡萄糖摄取调节能力，尤其体现在AA的α-淀粉酶抑制效能的提高以及OA-SLNs在降低处理培养基葡萄糖水平方面的增强作用。分子动力学模拟进一步证实了两者可与靶酶形成稳定复合物。虽然分子对接评分弱于标准药物阿卡波糖，但实验证据显示其生物学活性受溶解度等复杂因素影响，不能仅凭计算机预测否定其抑制作用。总体而言，本研究为开发基于SLNs的天然来源亲脂性抗糖尿病药物递送系统提供了重要的实验依据，为后续开展深入的动物体内药效学、药代动力学及安全性评价奠定了有价值的理论基础。相关成果发表于《Discover Pharmaceutical Sciences》。

（讨论部分总结）研究人员在讨论中指出，OA-SLNs在非禁食条件下的突出降糖效果可能与其更高的包封率和缓释特性有关，这与OA较低的熔点使其对脂质基质具有更强亲和力相一致。SLNs的粒径大小和表面活性剂种类（本研究所用polysorbate 80）是影响其细胞摄取和生物相容性的关键因素。关于分子对接与实验结果的差异，研究人员认为计算机模拟仅基于静态三维结构，无法完全涵盖溶解度、动力学因素等复杂生物学条件，因此计算结果需结合生物学实验进行验证。本研究的局限性包括：因计算资源限制未进行α-葡萄糖苷酶的MMGBSA计算与再对接分析；使用血糖仪间接评估葡萄糖摄取，灵敏度有限；且研究仅限于体外实验，无法全面评估制剂的体内安全性、生物相容性及药代动力学特征，研究结果应被视为初步证据而非有效性或安全性的最终验证，未来需通过体内研究加以确认。

（研究结论）本研究考察了负载OA和AA的SLNs相较于游离形式的抗糖尿病及细胞毒性效应，提示其可能需作为潜在抗糖尿病制剂进行进一步研究。负载OA和AA的SLNs表现出与游离OA和AA相似的α-淀粉酶抑制活性。在NF和IF条件下，与游离成分相比，制剂降低了处理培养基中的葡萄糖浓度。分子对接和分子动力学模拟结果揭示了OA和AA与α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的相互作用方式，提示其结合稳定并支持其抑制这些酶的潜力。值得注意的是，负载OA和AA的SLNs在HepG2、HEK293和Caco-2细胞中表现出低细胞毒性。综上所述，这些发现推荐进一步研究负载AA和OA的SLNs，将其作为递送具有抗糖尿病特性的亲脂性三萜类化合物的有效系统。