《Journal of Virological Methods》：Clinical and Analytical Validation of a Novel Switching RT-qPCR Assay for the Simultaneous Detection of Seven Respiratory Viruses
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摘要快速准确地识别呼吸道病毒对于有效的临床管理和感染控制至关重要。然而，传统的RT-qPCR方法耗时长，且需要复杂的操作流程。为克服这些局限性，我们开发了一种新型Switching RT-qPCR检测方法，用于多重检测呼吸道病毒，具有更高的效率和灵敏度。本研究旨在评估Swit
摘要
快速准确地识别呼吸道病毒对于有效的临床管理和感染控制至关重要。然而，传统的RT-qPCR方法耗时长，且需要复杂的操作流程。为克服这些局限性，我们开发了一种新型Switching RT-qPCR检测方法，用于多重检测呼吸道病毒，具有更高的效率和灵敏度。本研究旨在评估Switching RT-qPCR检测在检测七种主要呼吸道病毒（甲型/乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）A/B型、腺病毒（AdV）、人偏肺病毒（hMPV）以及严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2））中的分析性能和临床性能。
从有呼吸道症状的患者中收集鼻咽拭子标本（n = 808）。提取RNA后，分别使用Switching RT-qPCR检测和商业多重RT-qPCR方法（Allplex呼吸道检测面板和Allplex SARS-CoV-2检测）进行测试。比较两种方法的一致性、灵敏度、特异性和分析性能。
与传统检测方法相比，Switching RT-qPCR检测的临床灵敏度为93.6%，特异性为100%，总体一致率超过96%。在大多数病毒靶标中，分析灵敏度相当或更优，尤其是RSV A、AdV和hMPV。双联检测方法格式实现了每次反应同时高效检测两个靶标，在保持分析准确性的同时减少了总体检测时间。
该Switching RT-qPCR检测为呼吸道病毒检测提供了一种可靠、快速且高效的替代方案。其简化的双联格式及与标准分子诊断方法的高度一致性表明其在常规临床实验室中的应用潜力。
引言
下呼吸道感染仍然是全球范围内的主要发病和死亡原因。流感病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、腺病毒（AdV）、人偏肺病毒（hMPV），以及最近的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）等病毒病原体是主要的致病因子（Walsh et al., 2008, Jain et al., 2015, Iuliano et al., 2018, Li et al., 2022）。这些感染的临床表现相互重叠，增加了鉴别诊断的难度，尤其在季节性流行或多个病毒共同流行期间更为复杂。
在现有的诊断工具中，实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）因其高灵敏度和特异性被视为检测呼吸道病毒的金标准。然而，传统多重RT-qPCR由于引物竞争、二聚体形成以及共同扩增过程中的化学平衡饱和，往往导致分析灵敏度受限（Elnifro et al., 2000, Bustin et al., 2009）。虽然巢式PCR等多步法可以达到单拷贝灵敏度，但需要打开反应管，引入了劳动密集的操作流程和严重的残留污染风险（Hajia, 2018）。
为了在不牺牲工作流程简便性的前提下克服这些灵敏度和操作方面的限制，需要采用替代扩增策略。Switching-RT-qPCR是一种有前景的方法，在单管封闭反应中采用改进的扩增机制。该方法使用一种特殊设计的引物系统，包括限制引物、第二引物、反向引物和探针，以在单次反应中对多个病毒靶标进行灵敏且特异的检测。该检测方法旨在提高通量，同时保持标准单管操作的简便性。本研究使用临床标本评估了Switching RT-qPCR检测在检测甲型/乙型流感病毒、RSV A/B、AdV和hMPV中的分析和临床性能，并与传统RT-qPCR检测的结果进行了比较。
章节片段
临床标本
从京熙大学医院江东区院和绿十字实验室进行常规病毒检测的有呼吸道症状患者中获取残余鼻咽拭子标本。纳入此前已使用标准RT-qPCR方法检测病毒的样本。排除体积不足、结果不明确或确认多种病毒混合感染的标本。RNA提取使用SEEPREP32（Seegene，韩国首尔），按照
Switching RT-qPCR与传统检测之间的一致性
在第一阶段单联一致性分析中，共评估了431份鼻咽拭子标本（311份阳性，120份阴性），使用单联Switching RT-qPCR检测进行检测，并将结果与使用传统RT-qPCR检测获得的结果进行比较。阳性一致率为93.6%，阴性一致率为100%，所有检测标本的总体一致率超过96%。按病毒种类分层后，Cohen's kappa系数（κ）范围
讨论
准确、及时地识别呼吸道病毒在有效的患者管理和感染控制中起着关键作用，尤其是在后COVID-19时代。本研究证明，Switching RT-qPCR检测在检测主要呼吸道病毒（包括SARS-CoV-2、甲型/乙型流感病毒、RSV A/B、AdV和hMPV）方面达到了与传统RT-qPCR检测相当，在某些情况下甚至更优的诊断性能。这些呼吸道病毒常常引起严重的临床
结论
Switching RT-qPCR检测在解决与设备、人员和周转时间相关的局限性的同时保持高诊断性能，可作为传统RT-qPCR的实用替代方案。该检测的快速性、多重检测能力以及与现有PCR平台的兼容性，表明其适合在未来的资源受限环境和流行病或大流行期间应用。未来需要在多种病毒靶标中进行更大型的临床验证
伦理审批
伦理批准由京熙大学医院江东区院伦理委员会（IRB编号：KHNMC 2023-07-038）和绿十字实验室（IRB编号：GCL-2023-1067）授予。由于研究的回顾性质以及分析使用匿名临床数据，患者知情同意被免除。
伦理声明
作者未从参与者或其法定代表获得知情同意。由于研究的回顾性质以及分析使用匿名临床数据，患者知情同意被免除。
本研究包含器官或组织捐赠者。本研究包括人类生物材料，已征得捐赠者、其近亲或法定代表的同意，用于本研究及文章发表。本研究所使用的样本并未
未引用参考文献
（美国国家生物技术信息中心（n.d.））
CRediT作者贡献声明
Seo Tae Seok：调查研究、构思。 Phan Vu Minh：形式分析、数据整理。 Lee Min Young：撰写初稿、方法学、调查研究、形式分析、构思。 Lee Woo In：撰写审查与编辑、调查研究、构思。 Nguyen Hiep Van：形式分析、数据整理。
利益冲突声明
作者声明以下财务利益/个人关系，可能被视为潜在的利益冲突：作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本报告中所述的工作。本研究与HeimBiotek公司的Jae-Hoon Lee合作进行，该公司作为国家研究项目的一部分，主导开发了Switching RT-qPCR技术。
致谢
本研究得到了韩国健康技术研究开发项目通过韩国健康产业发展院（KHIDI）的资助支持，由大韩民国健康与福利部提供资金（项目编号：RS-2025-02263424和HI22C0426）。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本报告中所述的工作。本研究与来自的Jae-Hoon Lee合作进行
Min Young Lee|Vu Minh Phan|Hiep Van Nguyen|Woo In Lee|Tae Seok Seo
京熙大学医学院实验医学科，京熙大学医院江东区院，韩国首尔特别市
