无需纯化的化学转化偶联RT-PCR用于超低输入的a6A标记RNA检测和定量

《Methods》：Purification-free chemical conversion-coupled RT-PCR for ultralow-input detection and quantification of a6A-labelled RNA

摘要

核苷类似物介导的RNA标记为研究RNA合成、代谢周转和转录后调控提供了强有力的手段。然而，传统的检测工作流程通常需要化学处理、试剂去除和多次RNA纯化，这可能导致大量样品损失，并限制其在超低投入量样品中的应用。在此，我们提出了一种化学转化耦合RT-PCR方法，该方法在检测和定量N⁶-烯丙基腺苷（a⁶A）标记RNA时无需进行转化后的RNA纯化。碘诱导的环化反应将a⁶A转化为环化腺苷衍生物，该衍生物在逆转录过程中产生特征性的cDNA突变信号。通过消除碘去除、碱稳定化和转化后RNA纯化步骤，该工作流程可直接从化学反应混合物中进行逆转录，并减少了可能导致样品损失的操作步骤。通过对碘处理和逆转录酶兼容性的优化，确定Induro逆转录酶适用于定量分析，因为其在环化a⁶A位点处兼具高突变率与最高的预估读通效率。该方法可从飞克（femtogram）级别的投入量中检测到a⁶A标记RNA，并支持在广泛投入量范围内基于突变率的定量分析。通过使用超低量总RNA对携带不同poly(A)尾的IVT产生的mRNA进行时间分辨追踪，进一步验证了该方法的适用性。该工作流程为样品有限的情况下a⁶A标记RNA的检测和相对定量提供了灵敏的平台。

引言

追踪RNA分子对于理解RNA代谢、转录本周转和转录后调控至关重要[1]。当与测序技术结合时，RNA标记策略能够将新合成的、化学标记的或外源引入的RNA与预先存在的RNA群体区分开来[2]、[3]。这些方法提供了稳态测量无法轻易获得的时间维度信息，使研究RNA合成、加工、运输、降解和细胞内持久性成为可能。

已有多种核苷类似物被开发用于RNA标记[4]、[5]、[6]，包括4-硫尿苷（4sU）[7]、[8]、5-乙炔基尿苷（5-EU）[9]、5-溴尿苷（5-BrU）[10]、6-硫鸟苷（6sG）[11]、N⁶-丙炔基腺苷（p⁶A）[12]、[13]、[14]、2'-叠氮胞苷（2'-AzC）[15]、5-乙烯基尿苷（5-VUrd）[16]、N⁶-烯丙基腺苷（a⁶A）[17]和N⁴-烯丙基胞苷（a⁴C）[18]。根据其化学结构和生物学相容性，这些类似物既可通过体内标记代谢性地掺入新转录的RNA中，也可通过体外转录（IVT）引入到合成RNA中[19]。它们的独特官能团，包括巯基、炔基、叠氮基、乙烯基、卤素和烯丙基部分，为下游检测提供了可化学定位的反应位点[20]、[21]、[22]、[23]。这些检测模式已实现了新生RNA合成和周转的全转录组分析，以及特定RNA群体的可视化或追踪。此外，核苷类似物标记越来越多地应用于合成RNA，包括报告基因转录本、治疗性mRNA和化学修饰RNA探针，在这些应用中可促进对细胞内稳定性和降解动力学的评估。

尽管具有上述优势，许多当前的RNA标记工作流程依赖于多个顺序处理步骤，如化学衍生化、亲和富集、试剂去除、沉淀、柱纯化和RNA回收。每一步操作都引入了非特异性吸附、不完全回收或标记RNA降解的可能性。在微克或纳克水平的投入量下，这些损失的影响尚不显著，但在皮克至飞克水平的样品中则变得日益严重。在如此低的投入量下，即使是在管转移、沉淀、洗涤或膜纯化过程中的轻微损失，也可能显著减少可用于逆转录和扩增的RNA量[24]、[25]、[26]。这些限制对于涉及稀有细胞群体、单细胞材料、低丰度转录本、临床样本或少量合成RNA的应用尤为相关。对于这类样品，理想的工作流程应最大限度地减少操作步骤，避免亲和富集和反应后纯化，并保持与直接逆转录、扩增和定量分析的兼容性。因此，开发一种温和且无需纯化的化学转化策略，对于将核苷类似物基础的RNA分析扩展到超低投入量设置具有重要意义。

基于化学转化的测序方法通过将标记的核苷酸转化为在逆转录（RT）过程中产生特征性cDNA突变信号的损伤，提供了一种无需富集的替代方案[27]。由于这些突变信号可被测序直接识别，RNA标记的化学身份可以被编码为核苷酸分辨率的序列信息[28]、[29]。然而，许多现有的转化反应需要苛刻条件，转化效率有限，或者需要反应后纯化以去除抑制逆转录或PCR的残余试剂[30]、[31]、[32]。这些额外的处理步骤可能导致大量样品损失，在仅有皮克或飞克水平RNA投入量的情况下尤为成问题。因此，一种温和、高效且无需纯化的策略，能够直接将RNA标记转化为测序可检测的突变信号，对于低投入量RNA分析将极具价值。

N⁶-烯丙基腺苷（a⁶A）是一种颇具吸引力的腺苷类RNA标记，因为其烯丙基可以被选择性地转化为在逆转录过程中产生特征性错配信号的环状加合物。在温和的碘化条件下，a⁶A的烯丙基发生分子内环化反应，形成1,N⁶-环化腺苷（cyc-A），该产物破坏了规范的碱基配对并改变了cDNA合成过程中的核苷酸掺入[33]。除碘诱导的环化反应外，a⁶A的烯丙基还可以参与用于RNA功能化的生物正交反应，包括四嗪介导的反向电子需求Diels-Alder（IEDDA）环加成反应。这些化学转化凸显了a⁶A作为RNA标记和检测反应位点的多功能性[34]。碘诱导的环化反应先前已被应用于a⁶A、N⁶-异戊烯基腺苷（i⁶A）[35]以及m⁶A RNA修饰的测序检测[36]。因此，该反应提供了一种将含烯丙基的腺苷残基直接转化为测序可检测突变信号的手段。受先前碘诱导的i⁶A环化工作流程的启发——这些工作流程展示了简化的反应后处理策略[37]——我们假设碘诱导的a⁶A环化步骤可以直接与RT-PCR偶联，而无需中间试剂去除或RNA纯化。通过消除化学转化后的额外处理步骤，这种集成工作流程将最大限度地减少操作相关的样品损失，并提高与超低投入量RNA样品的兼容性。

为实现烯丙基标记RNA的超低投入量检测，我们开发了一种无需纯化的化学转化耦合RT-PCR工作流程，将温和的碘诱导环化反应与基于测序的突变检测相结合。该工作流程包括三个步骤：(1)直接对RNA进行碘化，以诱导a⁶A标记位点的环化；(2)在添加逆转录酶和RT试剂后，直接使用碘处理的反应混合物进行逆转录，无需碘去除、碱稳定化或转化后RNA纯化；(3)PCR扩增后进行文库制备和高通量测序（图1）。在逆转录过程中，cyc-A残基产生特征性cDNA突变信号，随后可通过测序进行识别和定量，从而实现a⁶A标记RNA的灵敏检测和相对定量。通过消除化学转化和逆转录之间的试剂去除和RNA回收步骤，这一简化工作流程减少了操作损失，简化了实验操作流程，并与皮克至飞克范围的RNA投入量保持兼容。

章节摘要

材料

RNA寡核苷酸和DNA引物购自北京天根生物科技股份有限公司（中国）。除另有说明外，化学试剂均购自源叶化学（中国）。N⁶-烯丙基腺苷（a⁶A）和a⁶ATP按照先前报道的程序合成[35]。TranscriptAid T7高产转录试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司（MAN0012652）。Induro逆转录酶购自New England Biolabs公司（M0681L），Maxima H Minus逆转...

a⁶A的简化碘诱导转化

为确定简化的反应设计是否损害了a⁶A的转化效率，我们首先通过高效液相色谱（HPLC）评估了碘化诱导的环化反应。在先前方案中，碘化后用过量的碘与硫代硫酸钠淬灭，随后用碳酸氢钠处理以稳定环化产物。因此，我们在三种条件下比较了a⁶A的转化效果：单独碘处理、淬灭碘化和碱稳定化。

HPLC

结论

在本研究中，我们开发了一种无需纯化的化学转化耦合RT-PCR工作流程，用于灵敏检测和定量a⁶A标记RNA。通过将碘诱导的环化反应直接耦合到逆转录过程，无需碘去除、碱稳定化或转化后RNA纯化，该工作流程最大限度地减少了操作相关的样品损失并简化了整体实验程序。通过优化碘浓度和逆转录酶...

作者贡献

S.J.和W.L.进行了实验。X.S.分析了数据，设计并监督了研究工作，并撰写了手稿。

资金来源

本研究得到四川省自然科学基金（2025ZNSFSC0937）的支持。

利益冲突声明

作者声明，他们没有任何已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

Shanshan Jiang | Wenping Li | Xiao Shu