【Nature 前沿速递】Covaris低温干式组织粉碎+聚焦超声系统赋能肝脏代谢组学NMR分析前的样本处理

肝细胞癌占原发性肝癌的 80%–85%，大多由慢性肝炎中发生恶性转化的肝细胞演变而来。内质网应激（ER 应激）与未折叠蛋白反应（UPR）已被证实与肝细胞癌相关，但 UPR 通路分子 ATF6α 在其中的作用尚不明确 。来自德国癌症研究中心、桑福德·伯纳姆·普雷比斯医学发现研究所、慕尼黑工业大学的团队在Nature 发表题为Activated ATF6α is a hepatic tumour driverrestricting immunosurveillance的文章，发现持续性 ATF6α 活化诱发内质网应激，通过糖酵解重编程造成肝癌微环境免疫抑制，同时使肿瘤对免疫检查点阻断治疗更敏感。该研究证实，持续活化的 ATF6α 是肝癌驱动基因，可作为免疫检查点阻断疗效分层标志物，也是肝癌潜在治疗靶点，为肝癌治疗提供新方向。

在组学研究中样本制备也非常重要，其中在代谢组学研究中会面临如何最大化提升代谢物提取效率的问题，Covaris CP02低温干式组织粉碎系统+Covaris E220 Evolution高性能自动声波聚焦系统能更好地解决这个问题。

CP02 低温干式组织粉碎系统+ E220 Evolution聚焦超声系统在代谢组学研究中的作用

文中提到基于核磁共振（NMR）波谱的代谢组学研究，为了最大化提升代谢物提取效率，在肝脏样本制备时采用了Covaris CP02低温干式组织粉碎系统+ Covaris E220 Evolution高性能自动声波聚焦系统。

1、取肝脏组织块，采用 Covaris cryoPREP CP02 低温干式组织粉碎系统低温研磨成粉

2、将组织粉末转移至 2 mL 自动声波聚焦玻璃管

3、加入 300 μL 超纯甲醇、1000 μL 甲基叔丁基醚重悬

4、使用 Covaris E220 Evolution高性能自动声波聚焦系统执行双相代谢物超声萃取程序

5、整套萃取包含两段连续超声程序，搭配样品垂直往复运动模式，最大化地提升代谢物提取效率

CP02 低温干式组织粉碎系统原理

CP02 低温干式组织粉碎系统的特点

 低温粉碎，保护生物大分子完整性

 干式粉碎，兼容多组学各种试剂

 可控的机械粉碎，重复性高

 快速，粉碎时间20毫秒

部分研究结果

ATF6α 活化是体内肝癌驱动因子

• 本研究采用空间转录组学技术，对经免疫组化（IHC）染色的人肝细胞癌连续切片划定感兴趣区域（ROI），分别选取 ATF6α 高表达、低表达区域开展测序（图 1j–l）；

• 相较于 ATF6α 低表达区域，转录特征显著分化的 ATF6α 高表达区域中，ATF6α 特异性分子伴侣 HSP90B1 及各类肿瘤相关基因的转录水平均明显上调（图 1k）；

• ATF6α 高表达与 PD-1–PD-L1 通路、CTLA-4 信号、缺氧通路、细胞周期进程及糖酵解通路激活显著相关；其中糖酵解通路激活伴随 FBP1 表达下调。FBP1 低表达与高侵袭性肝细胞癌亚型显著相关，同时提示肝癌患者生存期缩短（图 1l）；

• 在应激肝细胞与肝癌祖细胞中，FBP1 表达下调充当代谢开关：可逆转细胞衰老、促进细胞增殖，并推动代谢相关脂肪性肝炎衍生肝癌（MASH-HCC）中 DNA 损伤诱导的基因突变 。成像质谱流式（IMC） 结果显示，ATF6α 高度活化的肝癌患者样本，在不同空间分区（癌旁正常组织、肿瘤交界区、肿瘤核心区）的细胞组分发生重塑，涵盖肝实质细胞、基质细胞与各类免疫细胞（图 1m）；

• 与 ATF6α 低表达肿瘤区域相比，ATF6α 高表达区域的 CD8⁺T 细胞浸润程度更高，CD11c⁺等其他免疫细胞丰度同步上升；且该区域内 PD-1 阳性 CD8⁺T 细胞、PD-1 与 TIM3 双阳性终末耗竭型 T 细胞占比显著升高（图 1n–p）；

• 针对 CD8⁺T 细胞开展细胞邻域分析发现：ATF6α 高表达肿瘤中，CD8⁺T 细胞大量扩增并聚集形成细胞簇，周围环绕 CD11c⁺树突状细胞（DC）与 CD4⁺T 细胞，构成局部细胞调控中心；该结构与近年报道的肝脏免疫微龛特征相符，可局部增强 CD8⁺T 细胞的抗肿瘤应答 。在 ATF6α 高表达肝癌组织中，CD11c⁺树突状细胞优先与 CD8⁺T 细胞、FOXP3⁺CD4⁺调节性 T 细胞（Treg）共定位，提示局部免疫抑制水平升高；但对免疫检查点阻断疗法（ICB）敏感的 CD8⁺TCF1⁺T 细胞亚群，几乎不与 Treg 细胞发生共定位（图 1q）；

• 上述现象或可解释为何 ATF6α 高表达肿瘤对免疫检查点阻断治疗更敏感。为此，本研究纳入 83 例接受抗 PD-1 单药治疗的晚期肝癌患者样本开展验证 ，结果显示：达到完全缓解的患者，其肿瘤组织中 ATF6α 靶基因表达水平、人源 ATF6α 活化特征评分均显著更高（图 1r）。

图1. ATF6α 活化是体内肝癌驱动因子

ATF6α 活化使肝癌对免疫检查点阻断治疗敏感

活化 ATF6α 可将免疫 “冷肿瘤” 重塑为免疫抑制但可被 ICB 逆转的“热肿瘤”，提升肝癌对免疫检查点阻断的应答敏感性。

ATF6α 活化虽诱导 MDSC、CD8+PD-1+TIM3 + 耗竭 T 细胞等免疫抑制特征，但同时塑造独特、对 ICB 敏感的肿瘤微环境：

（1）形成 CD8+T 细胞、CD11c + 树突状细胞、CD4+T 细胞聚集的免疫枢纽；

（2）ICB 应答型 CD8+TCF1+T 细胞与免疫抑制 Treg 细胞空间分离 。

1、动物模型验证抗 PD-1 疗效依赖 ATF6α 活化

• 对 9 月龄自发肝癌TG^Alb-cre + 小鼠给予抗 PD-1 抗体治疗（图5i），可显著减少肿瘤数量、缩小瘤体、降低肝重 / 体重（图5j）；

• 免疫组化显示：抗 PD-1 治疗组肿瘤、癌旁肝组织 CD8+T 浸润增多，内质网应激标志物、肝癌标志物 AFP 无变化（图 5k）；

• 多重离子束成像（MIBI）单细胞蛋白定量显示：抗 PD-1 处理后肿瘤浸润 CD8+T 细胞乳酸脱氢酶（LDH，有氧糖酵解关键酶）表达显著升高（图 5l）；

2、 PD-1 基因敲除永久重建 ATF6α 活化小鼠抗肿瘤免疫

• 将 TG^Alb-cre + 小鼠与 Pdcd1⁻/⁻（PD-1敲除）小鼠杂交，获得 TG:Pdcd1⁻/⁻双基因修饰小鼠（图 5m）；

• TG:Pdcd1⁻/⁻小鼠肿瘤浸润 CD8+T 细胞数量升高，抗肿瘤监视功能恢复（图 5o）；

• PD-1 敲除显著延长 TG^Alb-cre + 小鼠生存期（图 5p）。

图5. 肝脏 ATF6α 活化通过代谢途径抑制抗肿瘤免疫监视

参考文献

Li, X., Lebeaupin, C., Kadianaki, A.et al. Activated ATF6α is a hepatic tumour driver restricting immunosurveillance. Nature 651, 796–807 (2026). https://doi.org/10.1038/s41586-025-10036-8

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