《Virchows Archiv》：Design and analytical validation of Nexthyro 2.0, a custom next-generation sequencing panel integrating DNA mutation profiling and RNA fusion detection for routine thyroid pathology specimens
编辑推荐：
分子检测在甲状腺病理中的作用日益增加，从术前对不确定细针穿刺抽吸（FNA）类别的分层到晚期癌的管理，促使各机构开发自定义下一代测序（NGS）方案，作为集中化检测的本地可部署替代方案。本研究旨在验证一种专门用于常规甲状腺病理标本分子分析的新型自定义NGS组合。该
分子检测在甲状腺病理中的作用日益增加，从术前对不确定细针穿刺抽吸（FNA）类别的分层到晚期癌的管理，促使各机构开发自定义下一代测序（NGS）方案，作为集中化检测的本地可部署替代方案。本研究旨在验证一种专门用于常规甲状腺病理标本分子分析的新型自定义NGS组合。该组合在甲状腺癌肿瘤细胞系、124例福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）甲状腺组织标本及43例FNA样本上进行评估。Nexthyro 2.0在组织学材料（100%）和细胞学材料（95.3%）上均实现高测序成功率，分析灵敏度低至0.5%稀释点。跨甲状腺肿瘤组织亚型与FNA类别的突变谱与已建立的分子-形态学相关性一致。Nexthyro 2.0代表了针对常规临床实践中遇到的细胞学与组织学标本进行甲状腺分子检测的可靠本地解决方案。
研究背景与问题提出：分子检测最初作为甲状腺结节诊断工作流程中的辅助工具，用于解决不确定细针穿刺抽吸（FNA）类别的诊断难题。尽管形态学标准与国际分类系统标准化减少了部分灰区，但有限核异型性、微滤泡和嗜酸细胞等特征仍难转化为可操作诊断类别。在术前不确定FNA分层、分化型甲状腺癌（DTC）风险再评估、晚期癌靶向治疗筛选中，分子数据价值持续提升。然而，美国以外的甲状腺专用下一代测序（NGS）组合稀缺，商用实体瘤组合常含非信息基因导致扩增子覆盖不足，且多不包含样本细胞量评估。研究人员此前历经7基因组合、商用泛癌NGS、自定义DNA窄板（Nexthyro 1.0）等阶段，仍存在TERT启动子（TERTp）覆盖不足、缺RNA融合与细胞量内控等问题，故升级构建Nexthyro 2.0，并在《Virchows Archiv》发表其设计与分析验证结果。
主要技术方法与队列：研究人员采用Ion AmpliSeq Designer设计DNA池（71扩增子，覆盖21基因285个COSMIC点突变，含TERTp多重叠引物）与RNA池（两池171扩增子，覆盖171个融合伴171伙伴基因，并嵌入滤泡细胞标记TG、PAX8、SLC5A5/NIS、KRT7，旁滤泡CALCA，甲状旁腺PTH表达内控，滤泡细胞标记读段占比>10%判足量大）。平台为全自动化Genexus系统，24小时内完成建库、测序与生信。分析灵敏度用FRO（BRAF p.V600E）与FB2（CCDC6::RET(12)）细胞系系列稀释（DNA稀释点30%–0.5%，RNA同步）评估，并以数字PCR（dPCR）正交验证TERTp c.?124C>T与c.?146C>T。真实队列含四家法国三级转诊机构124例FFPE甲状腺组织（病理医师HE定位宏切割）与本单位2024–2026年43例FNA（34针洗、7液基残余、2细胞块），共167例标本。
研究结果
分析灵敏度：BRAF p.V600E在0.5%稀释点仍可检（视觉LOD约1% VAF，实测低至0.5%）；CCDC6::RET(12)融合读段在最高稀释仍存，证实DNA/RNA alteration检出达0.5%水平。
组织学与细胞学队列测序表现：FFPE成功100%，FNA成功41/43（95.3%）。FFPE DNA中位靶向率93.77%、RNA 99.99%；FNA DNA靶向率82.42%、RNA 99.99%。较Nexthyro 1.0与前商用板，靶率与有效读段提升。
组织学样本：124例中98恶性（68 DTC、15 MTC、13 PDTC、2 ATC）。76例（61.3%）带≥1致病/可能致病变，66例为驱动事件。PTC中BRAF p.V600E占驱动66.7%，RAS样25%，融合8.3%（TPM3::NTRK1、CCDC6::RET）；RAS样在FA/NIFTP/IEFVPTC/FTC富集；PDTC中RAS 66.7%且TERTp共突变77.8%；ATC均NRAS p.Q61K；MTC以RET点突变（63.6%）为主；HTT见PAX8::GLIS1；NIFTP见NRAS/DICER1。TERTp共12例（PDTC 7、ATC 1等），dPCR一致。
细胞学样本：41例合格FNA中27例（65.9%）突变，21例驱动；恶性（M）类BRAF样占60%，不确定类（AUS/FN）RAS样占50%–75%，含PAX8::PPARG、RET p.M918T；TERTp 5例、PIK3CA 6例；共突变22.2%集中于M类。分子-形态学关联与组织学一致。
讨论与结论翻译：讨论指出，甲状腺分子检测已由不确定FNA分层扩展至DTC预后、手术范围决策及晚期/间变癌靶向用药；美外无一体化方案使自定义板合理。Nexthyro 2.0增RNA融合与表达内控、优化DNA范围、多重引物补TERTp CpG岛，FFPE/FNA成功率高，0.5%灵敏度亦支持未来液体活检验证。HTT的PAX8::GLIS1纳入可降过度治疗；TERTp孤立突变意义待研；MTC RET/HRAS为主伴罕见PIK3CA；DICER1/EIF1AX临床效用有限；FNA中BRAF样富集M类、RAS样富集不确定类、共突变提示高危。局限为FNA术后随访仅2例、嗜酸细胞病变少（CNV未捕）、融合板外罕见重排不排除、未做批内批间重复。结论：Nexthyro 2.0整合优化DNA突变板与RNA融合检测，扩自定义NGS参考范围；组织学/细胞学成功率高、灵密度0.5%稀释点，适常规甲状腺病理多标本类型；TERTp优化与GLIS融合目标拓宽诊预范围；需前瞻大队列随访确认术前临床效用。
