《Veterinary Medicine International》：Molecular Investigation of Plasmodium spp From Faecal Samples of Macaca fascicularis in Indonesia
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疟疾消除计划（Malaria Elimination Program, MEP）面临的威胁日益增多，如耐药性寄生虫、杀虫剂抗性蚊媒以及人兽共患疟疾。在东南亚，猕猴疟疾——诺氏疟原虫（*Plasmodium knowlesi*）的人兽共患性出现已成为MEP的主要
疟疾消除计划（Malaria Elimination Program, MEP）面临的威胁日益增多，如耐药性寄生虫、杀虫剂抗性蚊媒以及人兽共患疟疾。在东南亚，猕猴疟疾——诺氏疟原虫（*Plasmodium knowlesi*）的人兽共患性出现已成为MEP的主要关切。该寄生虫近期被确认，并可能定殖于东南亚本土野生动物食蟹猴（*Macaca fascicularis*）种群中。除*P. knowlesi*感染外，猕猴还可感染*P. inui*和*P. cynomolgi*，这些寄生虫均可能传播至人类。然而，来自印度尼西亚猕猴种群的寄生虫学数据十分匮乏。非侵入性采样方法是灵长类传染病生态学的主要工具。本研究旨在调查印度尼西亚食蟹猴粪便样本中的疟原虫属（*Plasmodium* spp）。研究人员收集了来自半圈养繁殖场所及野生*M. fascicularis*的粪便样本，共采集到来自爪哇岛（西爪哇）和苏门答腊岛（楠榜、巨港和占碑）的122份*M. fascicularis*粪便样本。提取DNA样本并进行巢式聚合酶链反应（nPCR）分析，使用线粒体DNA（mtDNA）引物组检测疟原虫属。共有46份（37.7%）样本疟疾检测呈阳性，并在其自然宿主中检测到四种疟原虫（*P. inui*、*P. cynomolgi*、*P. coatneyi*和*P. fieldi*）。所有粪便样本中均未鉴定出*P. knowlesi*阳性。本研究利用非侵入性样本提供了印度尼西亚*M. fascicularis*种群中猿猴疟原虫存在情况和多样性的基线信息，并强调了进一步开展野生动物宿主中猿猴疟原虫研究的重要性。
**印度尼西亚食蟹猴粪便样本中疟原虫属的分子调查——论文解读**
**一、研究背景与问题**
疟疾是一种由疟原虫属（*Plasmodium* spp）原虫引起的虫媒传染病，在全球尤其是热带和亚热带地区构成严重的公共卫生威胁。疟原虫种类繁多，不仅感染人类，还可感染鸟类、爬行动物及非人灵长类动物。通常，适应特定脊椎动物宿主的疟原虫种类不易跨宿主传播。然而，在东南亚地区，猕猴疟原虫——诺氏疟原虫（*Plasmodium knowlesi*）的人兽共患性出现已成为疟疾消除计划（MEP）的主要威胁。过去十年中，人类感染*P. knowlesi*的病例在东南亚持续增加，其在马来西亚婆罗洲沙捞越州加帛地区的大规模爆发引发了广泛关注。此外，猕猴还可感染*P. inui*和*P. cynomolgi*等亦可传播至人类的疟原虫种类。尽管印度尼西亚此前曾报道过猕猴疟疾，但相关研究仍然十分有限，主要原因在于野外猕猴捕获困难，几乎无法采集血液样本进行疟疾监测。因此，亟需一种非侵入性的采样方法以突破这一瓶颈。
**二、研究目的与意义**
本研究旨在利用非侵入性粪便样本，调查印度尼西亚食蟹猴（*Macaca fascicularis*）种群中疟原虫的存在情况、多样性及分子特征。此前已有研究成功从非洲猿类和旧世界猴的粪便样本中分离并测序出新型疟原虫种类，粪便样本在灵长类传染病生态学研究中的价值已得到验证。研究团队此前已开发并验证了一套基于粪便PCR的分子检测方案，其灵敏度达96.7%（95% CI：83.3%–99.4%），与血液样本检测性能相当。本研究基于这一验证方案，对来自印度尼西亚多个地理区域的食蟹猴粪便样本进行疟原虫检测，以填补该国猕猴疟疾寄生虫学数据的空白，为后续研究提供基线信息。论文发表于《Veterinary Medicine International》。
**三、主要技术方法**
研究人员采用便利抽样法，共采集122份食蟹猴粪便样本：90份来自半圈养猕猴群，其中西爪哇40份、苏门答腊楠榜24份、南苏门答腊巨港26份；32份来自占碑（苏门答腊）的野生猕猴群。半圈养样本采集于IPB大学灵长类研究中心（PRC）的迁地饲养设施，野生样本采集于占碑市穆罕默德·萨布基城市森林。粪便样本置于含RNAlater溶液的离心管中保存。使用QIAamp DNA Stool Mini Kit提取粪便DNA，采用巢式聚合酶链反应（nPCR）及再扩增方法，分别针对线粒体小亚基核糖体RNA（mt-ssrRNA）片段和细胞色素b（*cytb*）基因进行扩增，产物经纯化后进行Sanger双末端直接测序，测序结果通过BLAST比对、ClustalW及BioEdit软件进行序列比对分析，使用MEGA软件构建邻接（NJ）系统发育树。
**四、研究结果**
**4.1 疟原虫检测结果**
通过mt-ssrRNA引物PCR检测，122份样本中46份（37.7%）呈疟疾阳性。西爪哇、楠榜、巨港和占碑的检出率分别为27.5%（11/40）、29.2%（7/24）、73.1%（19/26）和28.1%（9/32），其中巨港样本检出率最高。通过BLAST比对分析，共鉴定出四种疟原虫：*P. inui*、*P. cynomolgi*、*P. coatneyi*和*P. fieldi*。*P. inui*为所有采样点的优势种，巨港和占碑的样本均为*P. inui*单一感染。西爪哇样本中鉴定出三种疟原虫，包括*P. inui*单感染（8份）、*P. cynomolgi*单感染（2份）及*P. coatneyi*/*P. inui*混合感染（1份）。楠榜样本中鉴定出*P. inui*单感染（6份）和*P. fieldi*单感染（1份）。总样本中单感染检出率（97.8%）远高于混合感染（2.2%）。
**4.2 DNA序列分析结果**
对*P. inui*阳性样本的*cytb*基因（约500 bp）进行比对后发现，来自西爪哇、楠榜和巨港的*P. inui*样本在部分*cytb*序列上无变异。从三个地区各选一份样本进行全长*cytb*基因（1,131 bp）测序及系统发育分析。与GenBank中10条参考序列比对后发现*P. inui*分离株间存在多态性，据此生成了单倍型分组。印度尼西亚分离株（#26楠榜、T3853西爪哇、H07巨港）彼此间遗传距离为零，与马来西亚/印度参考序列AB444112遗传距离最近（0.8%），与中国HM032052和台湾GQ355483参考序列的变异分别为1.9%和2.0%。NJ系统发育树显示，本研究的*P. inui*分离株聚为一支，与马来西亚半岛分离株亲缘关系较近，而区别于沙巴分离株，推测与其地理邻近性一致。中国和台湾的*P. inui*分离株聚为独立分支，但与本研究分离株的亲缘关系仍比沙巴分离株更近。此外，*P. cynomolgi*分离株T3875（西爪哇）和*P. fieldi*分离株与马来西亚半岛分离株的亲缘关系也比沙巴分离株更近。
**五、讨论与结论总结**
讨论部分指出，*P. inui*在巨港和占碑长尾猕猴中检出率最高，但各采样点的阳性率为分析样本比例，不能视为区域患病率估计。沙捞越加帛、沙巴地区的研究也报告了*P. inui*为优势种的一致结果，且马来西亚和泰国已出现*P. inui*自然感染人类的报告。*P. cynomolgi*的人兽共患感染已在马来西亚、柬埔寨和泰国多个地区报道，但沙巴一项涉及2000余份患者样本的回顾性研究未检测到*P. cynomolgi*。需要强调的是，仅在猕猴中检测到这些寄生虫并不能直接证明人兽共患传播。关于*P. knowlesi*，本研究未在印度尼西亚猕猴粪便样本中发现，尽管苏门答腊北部亚齐勿刹县已有人类感染*P. knowlesi*的报道，但该区域尚无猕猴感染*P. knowlesi*的公开记录。研究还承认Sanger直接测序对低丰度混合感染检测灵敏度有限，未来需借助深度测序或克隆方法提高分辨率。
结论部分：本研究从西爪哇、楠榜、巨港和占碑采集的*M. fascicularis*粪便样本中鉴定出四种疟原虫（*P. inui*、*P. cynomolgi*、*P. coatneyi*和*P. fieldi*）。*P. inui*是所有采样点的优势种类，也是亚洲地区分布最广的猴疟原虫。本研究中所有*P. inui*分离株在完整*cytb*基因上无多态性，均属于同一种群分布。未来研究应扩大采样范围至印度尼西亚其他猕猴自然分布区域，并结合蚊媒数据和人类感染数据，以更全面评估猿猴疟原虫的人兽共患风险。
