微 RNA (miRNAs) 在协调包括细胞增殖、分化和分裂在内的各种生物事件中发挥关键作用。[1], [2], [3] miRNA 表达失调与肿瘤发生和癌症进展密切相关，[4], [5], [6] 因此，miRNAs 作为肿瘤诊断和治疗的有价值生物标志物具有重要的前景。miRNAs 的可视化对于理解肿瘤发病机制和进展，以及基于成像的诊断和治疗评估具有重要意义。由于 miRNAs 序列极短、细胞内丰度低以及不同家族成员之间具有高度的序列同源性，miRNAs 的体内成像仍然具有挑战性。[7]
实现 miRNAs 的高质量体内成像需要高效的信号扩增策略和有效的探针递送载体。迄今为止，各种无酶扩增方法，如催化发夹组装 (CHA)，[8], [9] 链置换扩增 (SDA)，[10] 杂交链反应 (HCR)，[11] 和基于脱氧核酶的系统，[12], [13], [14], [15] 已被应用于 miRNA 检测和成像，然而它们的性能通常受到缺乏将信号扩增与高效探针递送相结合的集成平台的限制。在这方面，人工分子机器已作为能够在多个时空尺度上执行精确任务的通用工具而出现。[16] 得益于 DNA 的可编程性、结构可控性和多功能性，已经构建了许多基于 DNA 的分子机器，包括 DNA 齿轮，[17] 镊子，[18] 机器人，[19] 开关，[20] 步行器，[21] 等等。其中，DNA 步行器作为一类具有代表性的分子机器引起了特别的关注，并已被广泛探索用于体外和体内生物标志物的检测和成像。
DNA 步行器是一种动态的 DNA 纳米器件，通常由三个要素组成：行走轨道、行走链和驱动力。[22] 在适当力的驱动下，行走链能够沿着预定义的一维、二维或三维轨道自主运动，从而实现包括目标检测和分子诊疗一体化在内的多种应用。[23], [24], [25]
然而，传统 DNA 步行器系统的实际应用仍受到几个关键限制因素的阻碍。首先，大多数现有的 DNA 步行器依赖于无机纳米颗粒 (例如 AuNPs, Fe?O?) 作为行走轨道，这需要复杂的表面修饰和功能化程序，包括盐老化、巯基修饰和多轮离心，并且存在合成复杂和核酸装载效率低的问题。[26], [27], [28] 其次，系统设计本身就很复杂，需要同时优化多个参数，如行走链、底物链和轨道密度。此外，通常需要复杂的 DNA 序列设计或引入多个燃料链来精确控制行走方向和效率，进一步复杂化了优化过程。[29] 第三，基于杂交链反应或链置换的步行器系统的信号扩增效率受热力学限制，并且容易受到复杂生物环境的干扰。[26] 第四，固定在无机纳米颗粒表面的 DNA 探针容易受核酸酶降解，并且由于蛋白介导的外切核酸酶切割和全链解吸，在血清中的稳定性有限。[30] 即使采用 PEG 回填或高密度 DNA 装载等策略，保护效果仍然有限。[30] 由胆固醇修饰的 DNA 组装的脂质纳米球平台已被证明具有显著增强的核酸酶抗性 (提高多达 95 倍) 和高的血清稳定性，[31], [32] 使其更适合体内成像应用。
脱氧核酶，一类具有催化活性的单链 DNA 分子，由于其高催化效率、优异的稳定性和可编程性，已成为 DNA 步行器的强大驱动力。[13], [33] 与基于链置换反应的步行器相比，脱氧核酶驱动的步行器具有明显的优势：它们无需外部添加燃料链即可快速且持续运行，并通过循环底物切割实现显著的信号扩增，其运行效率比基于杂交的系统快约三个数量级。[29] 这些特性使脱氧核酶步行器成为生物传感和生物成像中有前景的信号放大器。然而，大多数报道的脱氧核酶步行器仍然构建在无机纳米颗粒支架 (例如 AuNPs) 上，这些支架存在复杂、耗时的制备程序，限制了它们的实际应用。[26], [28], [29] 因此，开发一种更方便和稳健的脱氧核酶步行器载体平台仍然非常令人向往。
最近，Li 等人展示了通过滚环扩增 (RCA) 仅用三条 DNA 链组装 3D DNA 纳米球用于 miRNA 检测。[34] 然而，这些纯 DNA 系统依赖于酶促反应和复杂的制备，限制了它们在活细胞或体内成像中的应用。在我们之前的研究中，我们通过四条 DNA 链的可编程组装 [35] 或 RCA [36] 构建了基于 DNA 纳米线的脱氧核酶步行器，并证明了它们在细胞内 miRNA 成像中的可行性。然而，这些系统仍然存在制备耗时和生理环境中生物稳定性有限的问题，这限制了它们的应用仅限于培养细胞，而体内成像仍未探索。
在此，我们报道了一种基于脂质纳米球的脱氧核酶步行器，该步行器通过胆固醇介导的疏水自组装快速组装，为体内 miRNA 成像提供了更方便和稳健的平台。如方案 1 所示，设计了一种分子信标 (MB) 以包括脱氧核酶的双臂结合序列、其底物核糖腺苷 (rA)、一个 FAM 荧光团和一个 Dabcyl 淬灭剂。脱氧核酶的一端与 Lock-4 链杂交形成锁定脱氧核酶，而游离端与 MB 杂交形成基于脱氧核酶的分子信标 (D-MB)。胆固醇修饰的 DNA (Chol-DNA) 自发组装成 DNA 脂质纳米球 (DLN)。然后将得到的 DLN 与 MB 和 D-MB 偶联，产生基于脱氧核酶驱动的分子信标脂质纳米步行器 (D-MBLN)。在细胞摄取后，D-MBLN 通过 Lock-4 的链置换被 miRNA-21 激活，释放脱氧核酶与 MB 杂交。在 Na?辅助下，脱氧核酶在 rA 位点切割底物，将 FAM 标记的链从 Dabcyl 淬灭中释放出来并恢复荧光。脱氧核酶对 DLN 表面的 MB 进行迭代切割，产生显著放大的信号。
构建的 D-MBLN 具有快速自组装、简化的基于脱氧核酶的识别 - 扩增集成、通过循环切割实现的高信号扩增以及由脂质纳米球载体赋予的高效细胞摄取和增强的生物稳定性。D-MBLN 实现了活细胞中 miRNA-21 的特异性成像，并在瘤内注射后，在小鼠肿瘤模型中实现了有效的体内成像。这项工作提供了一种简单而稳健的策略来构建高效的 DNA 步行器，脂质纳米球平台有望扩展核酸工具在生命系统中的应用，用于癌症诊断和预后。
