一种无需DNA纯化的快速LNA-PCR检测方法，可从血液裂解物中直接检测，用于诊断脊髓性肌萎缩症中的纯合SMN1基因缺失

《Scientific Reports》：A rapid LNA-PCR assay from blood lysate without DNA purification for the diagnosis of homozygous SMN1 deletion in spinal muscular atrophy

摘要

脊髓性肌萎缩症（SMA）是一种常染色体隐性遗传病，最常见的原因是SMN1基因第7外显子的纯合缺失。早期且可靠的分子诊断对于临床管理、遗传咨询以及新兴治疗手段的实施至关重要。然而，许多分子诊断方法需要DNA纯化及复杂的实验室操作流程，这可能会延长检测时间并增加成本。在这项研究中，我们旨在开发一种基于直接锁定核酸聚合酶链反应（LNA-PCR）的快速简化分子诊断方法，无需进行DNA纯化即可检测SMN1基因的纯合缺失。我们收集了792名个体的外周血样本，其中包括61名通过多重连接依赖性探针扩增（MLPA）确诊的SMA患者、45名经MLPA验证的健康对照者、56名SMA携带者，以及630名年龄超过40年的健康对照者（他们在2022年9月至2025年1月期间没有出现与SMA相关的症状）。实验使用针对SMN1基因的锁定核酸修饰引物和β-actin基因作为内参，进行了实时聚合酶链反应。整个反应体积为10 μL，仅使用了2.5 μL的血液裂解液，无需提取DNA。通过扩增情况来判断是否存在SMN1基因的纯合缺失。所有样本中均成功扩增了β-actin基因，说明实验过程正常。在60名通过MLPA确诊为SMN1基因纯合缺失的患者中，直接LNA-PCR方法正确检测出了57例，灵敏度为95.00%（95%置信区间：86.3–98.4%）。在102名经MLPA验证为阴性的个体（45名健康对照者、56名携带者和1名复合杂合患者）中未发现假阳性结果，特异性为100%（95%置信区间：96.5–100%），阳性预测值（PPV）为100%（95%置信区间：93.7–100%），阴性预测值（NPV）为97.14%（95%置信区间：92.1–99.1%），总体诊断准确率为98.15%（95%置信区间：94.7–99.6%）。该复合杂合患者仍被归类为SMN1阳性，这反映了基于实时聚合酶链反应的方法在识别序列变异方面的局限性。总体而言，该方法在检测SMN1基因纯合缺失方面表现出较高的诊断准确性和稳健的性能。直接LNA-PCR方法能够快速、可靠且经济高效地直接从血液样本中检测出SMN1基因的纯合缺失，简化了实验流程，有助于在常规临床实验室和资源有限的条件下更广泛地推广SMA的分子检测。