自持性的ROS响应性水凝胶用于通过PDT（光动力疗法）-表观遗传蛋白降解来递送PROTAC/Ce6纳米颗粒，从而放大焦亡效应，以增强癌症免疫疗法效果

《Biomaterials》：Self-Sustaining ROS-Responsive Hydrogel Enabled Delivery of PROTAC/Ce6 Nanoparticles via PDT-Epigenetic Protein Degradation to Amplify Pyroptosis for Enhanced Cancer Immunotherapy

摘要：癌症免疫疗法在免疫学上“冷”的肿瘤中效果有限，这是由于T细胞浸润不足和肿瘤微环境具有免疫抑制作用。光动力疗法（PDT）的效果受到光敏剂在肿瘤中的特异性聚集不足以及由表观遗传学调控的治疗抵抗性的限制。在此，我们设计了一种光驱动的、响应活性氧（ROS）的水凝胶（PACL@Gel），用于装载包裹蛋白酶体靶向嵌合体（PROTAC）分子和光敏剂的肽-脂质支架纳米颗粒，以增强癌症免疫疗法。该系统利用内源性ROS和光动力扩增的ROS来驱动水凝胶的 controlled 分解和纳米颗粒的释放，建立了一个自我维持的ROS反馈循环，以克服内源性ROS不足的限制。释放的PACL纳米颗粒将PDT与表观遗传学BRD4蛋白降解协同作用，从而显著增强Caspase-3/GSDME依赖的焦亡。焦亡的肿瘤细胞会触发免疫原性细胞死亡，释放炎症 mediator 和损伤相关分子模式，促进树突状细胞的成熟和T细胞的激活与浸润，有效重塑免疫抑制的肿瘤微环境，并促进抗肿瘤免疫力。实验结果验证，在激光照射下，PACL@Gel表现出强大的局部肿瘤抑制作用和远端消融效应，防止术后复发，并建立了长期免疫记忆。总体而言，这种集成的PROTAC-PDT水凝胶平台有效重新编程了免疫抑制的肿瘤微环境，为提高免疫学上“冷”的肿瘤中的PDT疗法提供了一种强大且可行的方法。

引言：近年来，癌症免疫疗法作为肿瘤治疗的革命性支柱之一，与手术、放射疗法和化疗并驾齐驱[1]。特别是，以免疫检查点抑制剂为代表的癌症免疫疗法在多种晚期实体瘤（如黑色素瘤和非小细胞肺癌）中取得了前所未有的持久疗效，标志着“免疫疗法时代”的到来[2]、[3]、[4]。然而，癌症免疫疗法在免疫学上“冷”的肿瘤中的效果仍然有限，这主要是由于T细胞（CTL）在肿瘤微环境中的浸润不足[5]、[6]、[7]。当前研究的核心是开发策略，将免疫学上“冷”的肿瘤转化为“热”的肿瘤，从而增强CTL的浸润并改善治疗效果。焦亡作为一种炎症性细胞死亡形式，可以在肿瘤中触发强烈的免疫原性细胞死亡（ICD），其特征是膜穿孔和细胞肿胀，导致肿瘤相关抗原、损伤相关分子模式（DAMPs）和细胞因子的快速释放[8]、[9]、[10]。这些释放的免疫信号分子促进树突状细胞（DCs）的成熟，并有助于向T细胞呈现抗原，最终显著促进CTL在肿瘤内的浸润[11]、[12]、[13]。研究表明，在光动力疗法（PDT）中，光敏剂在激光照射下可以产生大量的活性氧（ROS），最终导致Caspase-3/gasdermin E（GSDME）依赖的焦亡[14]、[15]。因此，PDT诱导的焦亡代表了增强癌症免疫疗法的一种有前景的策略。由于肿瘤微环境的复杂性，PDT的效果受到多种限制，如损伤修复系统和促进生存的信号传导、抗氧化系统的激活、由表观遗传学修饰引起的药物抵抗以及免疫抑制的微环境[16]、[17]、[18]、[19]。其中，表观遗传学修饰，如组蛋白的翻译后甲基化和乙酰化，在促进肿瘤免疫逃逸和对化疗和放疗的抵抗机制中起着关键调节作用[20]、[21]、[22]。溴结构域蛋白4（BRD4）作为表观遗传调节因子，主要调节参与细胞周期进展、DNA损伤修复、炎症和免疫反应的基因表达[23]、[24]、[25]。最近的研究表明，BRD4在介导巨噬细胞的炎症反应和促进巨噬细胞向M2极化方面起着关键作用，从而通过调节相关基因的转录来促进肿瘤生长[26]、[27]、[28]。此外，杨等人证明PDT上调了Ccl5基因的转录和蛋白表达。矛盾的是，这种趋化因子的升高通过促进M2巨噬细胞的极化和招募，以及扩大调节性T细胞（Tregs）的数量，削弱了PDT的抗肿瘤效果，从而强化了免疫抑制的肿瘤微环境并加剧了对PDT的抵抗。从机制上讲，针对BRD4蛋白的靶向降解可以干扰其与Ccl5启动子的结合，导致Ccl5的转录和蛋白合成受到抑制，进而对抗PDT的抵抗[29]。此外，针对BRD4的降解剂已被发现对T细胞活性具有调节作用[30]、[31]，这可以进一步增强PDT介导的免疫反应。因此，通过溴结构域抑制剂靶向BRD4可能成为一种有前景的表观遗传策略，用于增强PDT介导的肿瘤治疗并逆转耐药性[32]。然而，传统的小分子抑制剂受到其“占据驱动”机制的限制，需要与目标活性位点持续高亲和力结合才能有效竞争内源性配体[33]。这种固有的缺点通常导致药理学抑制不足和药物抵抗的产生，最终限制了其更广泛的临床应用[34]、[35]。迫切需要开发与传统小分子抑制剂根本不同的替代策略。蛋白酶体靶向嵌合体（PROTAC）技术是近年来出现的一种蛋白质降解技术，通过针对泛素-蛋白酶体系统（UPS）的蛋白质阻断机制实现高度特异的蛋白质降解[36]、[37]、[38]。PROTAC具有独特的三元复合体结构，同时连接目标蛋白（POI）和E3泛素连接酶，使它们在空间上紧密邻近，从而促进目标蛋白的降解[39]、[40]。与小分子抑制剂的“占据驱动”机制不同，PROTAC通过“事件驱动”机制工作，能够在催化浓度下短暂结合目标蛋白时直接触发蛋白质降解途径[41]、[42]、[43]。因此，PROTAC代表了肿瘤学中的变革性模式，因为其提高了治疗效果，降低了用药剂量要求，并具有独特的能力来攻击以前“不可成药”的目标[44]、[45]。然而，大多数PROTAC的水溶性差且膜渗透性低，导致药代动力学不佳和生物利用度低[46]、[47]。PROTAC缺乏肿瘤特异性和非特异性全身分布可能会引起全身毒性，严重限制其临床应用[48]。因此，开发新型高效的药物递送系统对于PROTAC的成功临床转化和应用至关重要。水凝胶系统因其良好的物理化学和生物学特性（如可注射性、生物相容性和持续释放能力）而成为药物递送的吸引人平台[49]、[50]、[51]。特别是在肿瘤治疗中，通过肿瘤内注射或术后腔内填充水凝胶可以在靶点处实现持续和高浓度的药物[52]、[53]。与全身给药相比，这种方法将药物主要限制在病变部位，显著减少脱靶分布和全身毒性[54]、[55]。然而，水凝胶的强机械性能可能成为物理屏障，阻碍药物扩散，常常导致释放不完全或不足，从而无法达到治疗效果所需的浓度[56]、[57]。即使对于像ROS敏感水凝胶这样的内源性信号响应系统，肿瘤中的局部ROS水平可能仍然不足以可靠地触发ROS敏感键的断裂并达到释放药物所需的阈值。因此，需要开发能够在原位生成ROS的策略，以精确控制ROS响应水凝胶中的药物释放，以实现其全部治疗潜力。在这项工作中，我们设计了一种光驱动的ROS响应水凝胶系统（PACL@Gel），用于装载包裹PROTAC分子ARV-825和光敏剂氯胺酮e6（Ce6）的肽-脂质支架纳米颗粒（图1）。该系统利用肿瘤微环境中的内源性ROS来断裂水凝胶中的ROS响应性动态苯硼酸酯键，触发水凝胶的逐步降解，并实现持续的PACL纳米颗粒释放，以维持药物浓度。在外部光照刺激下，Ce6可以产生高水平的ROS，进一步加速水凝胶降解，建立原位的ROS正反馈循环。释放的PACL纳米颗粒通过R4F肽的作用与肿瘤细胞表面高度表达的Scavenger Receptor Type B1（SR-B1）结合，促进细胞摄取，通过“PDT-表观遗传蛋白降解”发挥协同抗肿瘤作用。令人惊讶的是，ARV-825介导的BRD4蛋白降解可以协同增强PDT诱导的Caspase-3/N-GSDME依赖的焦亡效应，通过提高Caspase-3蛋白的水平。体外和体内实验表明，光驱动的PACL@Gel诱导的放大焦亡不仅增强了全身抗肿瘤免疫力，抑制了原发肿瘤和远处肿瘤的生长，还建立了由记忆T细胞介导的长期免疫记忆，抑制了肿瘤转移和复发。这项研究构建了一个基于水凝胶的多功能集成协同治疗平台，为通过表观遗传策略联合应用PROTAC药物以增强癌症免疫疗法中的PDT治疗提供了新的见解。

### PACL的制备和表征
为了有效地封装ARV-825和Ce6，我们根据先前的研究设计了肽-磷脂支架纳米颗粒[58]。具体来说，首先将DMPC、CO、DSPE-PEG2000、ARV-825和Ce6的混合溶液制成薄膜，然后用PBS水化得到混合脂质溶液（ACL），使用薄膜分散方法。随后，将R4F肽溶液逐滴加入到脂质混合物中，并在4°C下孵育过夜以获得PACL纳米颗粒。