人巨细胞病毒vGPCR UL33对于上皮细胞中的高效裂解性复制至关重要

《Journal of Virology》：The human cytomegalovirus vGPCR UL33 is essential for efficient lytic replication in epithelial cells

摘要
人巨细胞病毒（HCMV）是一种在人类群体中普遍存在的β-疱疹病毒。HCMV拥有人类疱疹病毒中最大的基因组，并编码一系列影响不同细胞类型中致病性的基因。鉴于HCMV能在多种细胞类型中复制，研究人员已开始鉴定细胞类型特异性复制所需的病毒蛋白。HCMV编码四种与G蛋白偶联受体（GPCR）同源的蛋白；这些病毒GPCR（vGPCR）为UL33、UL78、US27和US28。在本研究中，研究人员发现，删除全部四个vGPCR基因会严重削弱HCMV在原代人唾液腺上皮细胞和ARPE-19视网膜上皮细胞中的裂解性复制，表现为病毒基因表达和病毒产生量的下降。从HCMV基因组中删除UL33同样导致病毒在上皮细胞中无法高效复制，该缺陷表现为病毒基因表达水平和病毒产生量的降低。研究人员发现，与US28类似，UL33在上皮细胞中组成性激活Gαq信号至高水平。研究人员还发现，UL33的转录比原先认为的更为复杂，病毒有可能利用不同的5′非翻译区（5′ UTR）产生新型UL33蛋白，这些蛋白均能够进行组成性Gαq信号传导。综上所述，这些研究提供了关于UL33表达、亚细胞定位和信号传导的新型分子与生化数据，并表明UL33活性对于HCMV在上皮来源细胞中的高效复制至关重要。
重要性
人巨细胞病毒（HCMV）在体内多种细胞类型和组织中复制，参与细胞类型特异性复制的病毒基因刚刚开始被阐明。HCMV编码的病毒G蛋白偶联受体（vGPCR）UL33、UL78、US27和US28被证明在HCMV复制的多个方面发挥重要作用，包括潜伏期的建立和维持。在此，研究人员证明HCMV vGPCR，特别是UL33，在驱动上皮来源细胞（包括来自唾液腺的细胞）的裂解性复制中发挥重要作用。这项工作拓展了对vGPCR潜在功能的认识，将推动未来研究从机制上理解它们如何影响嗜性，并为未来的治疗提供了新靶点。

论文解读：人巨细胞病毒vGPCR UL33在上皮细胞高效裂解性复制中的关键作用

人巨细胞病毒（HCMV）是一种在人群中广泛传播的β-疱疹病毒，成人血清阳性率约为60%–90%。HCMV感染通常经唾液传播，虽然在免疫功能正常者中多表现为轻微症状，但在免疫功能低下患者和先天性感染新生儿中可导致严重疾病，如视网膜炎、肝炎、神经发育迟缓和感音神经性听力丧失。HCMV具有最大的疱疹病毒基因组，编码多种与致病性相关的蛋白。病毒在体内可经历裂解性复制、潜伏和再激活等多个感染阶段，其中裂解性复制常发生于鼻咽上皮和唾液腺上皮，而潜伏感染则见于造血祖细胞等髓系细胞。唾液腺上皮中的持续复制对病毒水平传播至关重要。目前对控制细胞类型特异性复制的病毒基因及其机制的认识仍不完善。

G蛋白偶联受体（GPCR）是具有七次跨膜结构域的细胞表面蛋白，可通过异三聚体G蛋白触发信号级联。HCMV基因组编码四种与GPCR同源的病毒GPCR（vGPCR）：UL33、UL78、US27和US28。这些vGPCR也存在于病毒包膜中，提示其可能参与感染早期过程。尽管vGPCR在所有测序病毒分离株中高度保守，但在成纤维细胞中它们对裂解性复制基本非必需。其中US28研究最为深入，而UL33在HCMV中的功能仍不清楚。啮齿类巨细胞病毒中UL33直系同源物（如小鼠CMV的M33和大鼠CMV的R33）对体内复制和致病性至关重要，特别是在唾液腺中的复制和传播中发挥关键作用。因此，HCMV UL33可能也在上皮细胞感染中具有重要功能，但尚缺乏直接证据。

研究人员为探究UL33在上皮细胞感染中的作用，首先构建了缺失全部四个vGPCR基因的HCMV突变病毒（TB40/E-Δall），并利用原代人唾液腺上皮细胞（hSGE）和ARPE-19视网膜色素上皮细胞模型进行感染实验。结果表明，与野生型病毒相比，Δall突变病毒在hSGE和ARPE-19细胞中的即刻早期（IE）基因表达和病毒产量显著降低。进一步单独缺失UL33开放阅读框（ORF）的病毒（UL33Δ）在ARPE-19细胞和原代hSGE细胞中的复制也明显受损，且IE、早期（E）和晚期（L）蛋白表达及相应mRNA水平均显著下降，提示UL33在病毒基因转录之前的阶段发挥作用。

研究人员还通过构建携带C端FLAG标签的重组病毒，检测了四种vGPCR在ARPE-19细胞感染中的蛋白表达动态。结果显示UL33和US27呈晚期表达特征，UL78呈早期表达，US28在感染后期高表达。UL33定位于病毒组装复合体（VAC），并表现为真正的晚期表达动力学（对膦酰乙酸敏感）。在信号传导方面，研究人员建立了多西环素（DOX）诱导的稳定表达ARPE-19细胞系，分别表达四种vGPCR。通过检测磷脂酶C-β（PLC-β）活性（以肌醇磷酸积累为指标），发现US28和全长UL33（UL33N）均能通过Gαq组成性激活PLC-β信号，而US27和UL78无此活性。使用Gαq特异性抑制剂YM254890可阻断该信号，证实UL33N偶联Gαq。此外，氨基端截短的UL33变体（UL33S）丧失信号诱导能力，说明UL33的氨基端对其信号功能至关重要。

研究人员还通过多聚体分离/RNA测序（polysome/RNAseq）发现UL33基因区域的转录比已知的更复杂。除原有的两个外显子（现命名为外显子3和4）外，还鉴定到两个上游新外显子（外显子1和2），可形成具有不同5′非翻译区（5′ UTR）的多种mRNA。此外，外显子3的延长形式（E3+201）包含一个上游起始密码子，可编码在UL33N氨基端额外增加24个氨基酸的新型UL33蛋白变体。研究人员在感染的人成纤维细胞和ARPE-19细胞中通过RT-qPCR确认了这些剪接连接的存在。进一步构建四种UL33转录变体的稳定表达细胞系后，发现所有变体均能产生稳定蛋白，并能同等程度地诱导Gαq/PLC-β信号。这表明UL33基因表达具有转录复杂性，但不同5′ UTR和氨基端延长对信号功能无显著影响。

讨论部分指出，HCMV vGPCR在裂解性复制中的作用曾被忽视，但越来越多的证据支持它们在感染各阶段的重要功能。UL33对上皮细胞复制的必要性与其啮齿类直系同源物在体内唾液腺上皮中的功能一致。由于UL33蛋白存在于病毒颗粒中，病毒粒子递送的UL33可能在感染极早期影响IE基因表达，而新合成的UL33则在后期发挥作用。UL33与US28都能通过Gαq激活PLC-β，但两者表达动力学不同，这可能反映了病毒在不同感染时间维持高信号水平的需求。关于UL33S无法信号的原因，可能涉及蛋白无法正确运输到细胞表面，或其氨基端作为“束缚配体”参与受体自激活的机制。最近发表的UL33冷冻电镜结构支持氨基端作为内在配体自激活受体的结论。新发现的两个上游外显子可能为转录调控提供额外位点，但其生物学意义尚待阐明。

结论：本研究揭示了HCMV vGPCR特别是UL33在上皮细胞裂解性复制中的关键作用。UL33通过Gαq组成性激活PLC-β信号，其氨基端对信号功能至关重要。UL33基因的转录存在多种剪接变体，产生功能等效的蛋白。这些发现为理解HCMV在唾液腺上皮中的持续复制和水平传播机制提供了新线索，也为干预HCMV感染提供了潜在的新靶点。