《Methods and Protocols》：A Single-Tube Nested PCR Method for SMN1 Deletion Detection in Spinal Muscular Atrophy
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脊髓性肌萎缩症（SMA）是一种罕见的常染色体隐性神经肌肉疾病，主要由SMN1基因的纯合缺失引起，导致下运动神经元变性以及进行性肌无力和肌萎缩。近年来，部分国家已采用干血斑（DBS）和基于PCR的检测方法开展SMA新生儿筛查项目，从而实现症状前诊断和更早的治疗启
脊髓性肌萎缩症（SMA）是一种罕见的常染色体隐性神经肌肉疾病，主要由SMN1基因的纯合缺失引起，导致下运动神经元变性以及进行性肌无力和肌萎缩。近年来，部分国家已采用干血斑（DBS）和基于PCR的检测方法开展SMA新生儿筛查项目，从而实现症状前诊断和更早的治疗启动。然而，新生儿筛查并未消除常规临床实践中诊断检测的需求，因为具有较轻或可行走表型的青少年和成人患者仍可能在症状出现后才就诊，并可能经历诊断延迟。因此，研究人员开发了一种单管巢式PCR（STNPCR）方法，作为疑似SMA的症状性患者的实用诊断手段。该方法仅需标准PCR程序和凝胶电泳即可检测SMN1纯合缺失，有助于识别未被新生儿筛查覆盖的SMA患者。本研究使用干血斑样本的检测在该概念验证队列中显示出初步技术可行性，但在其诊断效用得以确立之前，仍需在更大的独立队列中进行进一步验证。
论文解读：基于单管巢式PCR的SMN1基因缺失检测方法及其在脊髓性肌萎缩症诊断中的应用
一、研究背景与意义
脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy, SMA）是一组遗传性神经肌肉疾病，本文所指的是5q相关SMA，一种由5号染色体上运动神经元生存基因1（survival motor neuron 1, SMN1）双等位基因变异引起的罕见常染色体隐性遗传病。该病发病率约为每10万活产儿中1例，患病率估计为每10万人中1至2例。约95%的SMA患者由SMN1基因纯合缺失所致，最常见的机制为基因缺失或基因转换。
SMA曾被认为是不治之症，但自2016年疾病修饰疗法（disease-modifying therapies, DMTs）进入临床应用以来，其临床管理发生了显著变化。这些疗法通过提高SMN蛋白水平来改善疾病严重程度、运动功能和生存率。临床研究表明，在症状出现前启动治疗（包括nusinersen和onasemnogene abeparvovec）的患者预后优于症状出现后治疗者，部分症状前治疗婴儿的运动发育接近正常水平。这些发现强力支持了SMA新生儿筛查的推广，多国已采用干血斑（dried blood spot, DBS）和基于PCR的检测方法建立了SMA新生儿筛查项目。
然而，SMA新生儿筛查在各国和各地区的实施并不均衡。Vr??aj等人对143个国家的专家进行问卷调查，结果显示截至2023年有31个国家实施了SMA新生儿筛查，至2024年初增至33个。部分国家因政府支持有限、资源约束和医疗优先事项差异，新生儿筛查的推行仍面临挑战。此外，即使在已引入新生儿筛查的国家，已度过新生儿期的年长SMA患者无法受益于筛查，可能出现诊断延迟，错失在疾病进展关键早期阶段及时获得DMTs的机会。因此，针对有SMA样症状的患者建立实用的基因检测策略仍然十分必要。本研究正是在此背景下开展，旨在开发一种适用于症状性疑似SMA患者的实用基因检测方法。该论文发表于《Methods and Protocols》。
二、关键技术与方法
研究人员利用20份残留干血斑样本（来自10名SMA患者和10名对照者）开展概念验证研究。SMA患者此前已通过PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析基于新鲜血液确诊为SMN1缺陷型SMA，对照者为经PCR-RFLP确认为至少携带一份SMN1拷贝的非SMA个体。该研究经神户大学医学研究生院伦理委员会（编号B230027，2023年6月14日批准）和神户学院大学伦理委员会（编号23-02，2023年10月16日批准）批准，并遵守《赫尔辛基宣言》。
核心技术为单管巢式PCR（STNPCR）系统，包含三步流程：（1）制备微小干血斑圆片（直径1.2 mm）直接置于PCR反应混合物中；（2）在常规PCR或实时PCR仪中进行STNPCR；（3）通过凝胶电泳检测STNPCR产物中SMN1基因的存在与否。STNPCR包含两个扩增阶段：第一阶段使用外引物对R111和Intron 7-R通过不对称PCR扩增包含SMN1和/或SMN2序列的241 bp较长片段（所有个体均含有SMN1或SMN2，因此该片段总能扩增）；第二阶段使用内引物mCOP-F（SMN1特异性短引物，约10个核苷酸）和Intron 7-R在37°C退火温度下特异性扩增包含SMN1特异性核苷酸（外显子7中c.840位点C）的84 bp巢式产物。第一阶段不对称PCR条件（R111浓度为30 nM，Intron 7-R为300 nM）旨在最大限度减少残留R111引物对第二阶段mCOP-F退火的干扰。整个反应在单管内封闭完成，可降低污染风险。
三、研究结果
3.1 STNPCR技术的试验实验
研究人员使用对照个体的干血斑样本进行STNPCR试验，第一、二阶段均设20个循环。凝胶电泳成功获得两条条带：241 bp外引物对产物（初级扩增子）和84 bp内引物对产物（巢式扩增子，即SMN1特异性产物）。SMN1与SMN2外显子7及其侧翼区域序列比对显示两个核苷酸差异：一个位于内含子6（SMN1为G，SMN2为A），另一个位于外显子7（SMN1为C，SMN2为T，即c.840位点）。mCOP-F引物特异性退火至SMN1外显子7的C核苷酸，而不与SMN2外显子7的T核苷酸结合。
3.2第二阶段扩增循环数的优化
为避免假阳性和假阴性结果，研究人员将第一阶段循环数固定为20个，改变第二阶段循环数（13至19个）。结果显示，第二阶段15至19个循环时，对照干血斑样本呈现初级扩增子和巢式扩增子两条清晰条带，而SMA干血斑样本仅显示初级扩增子单一条带。然而，第二阶段13个循环时，对照干血斑的巢式扩增子条带极微弱（几乎不可检测），可能导致假阳性结果。实验中未观察到非特异性扩增产物条带。基于这些结果，后续实验采用第二阶段15个循环。
3.3使用干血斑样本建立SMN1存在/缺失检测
在凝胶电泳上，对照样本显示两条条带（241 bp初级扩增子和84 bp巢式扩增子），而SMA患者仅显示一条241 bp条带，无84 bp巢式扩增子。采用第一阶段20个循环、第二阶段15个循环的条件，所有SMA患者干血斑样本均仅显示初级扩增子条带，无巢式扩增子条带，结果与RFLP分析预期一致。但个别对照样本（C1）的上方条带不够清晰，研究人员指出干血斑样本作为模板时可能出现条带强度差异，这种变异不一定表明SMN1缺失，需谨慎解读结果以避免错误结论，不典型条带模式应仔细复核。
四、讨论与结论
本研究的原始概念基于两项核心原则：其一，当可用DNA量有限时，两管巢式PCR可实现靶序列的可靠扩增；其二，短mCOP引物具有高序列特异性，不易与含单核苷酸错配的模板退火。本研究开发的STNPCR系统将此前两管巢式PCR的两个扩增步骤整合至单管中完成，这看似微小的技术改进却具有重要的实践意义。mCOP引物长度约10个核苷酸，比常规20至30个核苷酸的PCR引物短，基因特异性核苷酸位于其中心位置，可在约37°C的退火温度下发挥功能，远低于第一轮扩增所用温度。利用这种退火温度差异，STNPCR可在单管内完成。
本系统存在以下局限性：SMN1存在/缺失检测仅能判断SMN1的存在与否，无法确定SMN1或SMN2的拷贝数，因此不能识别SMA携带者，也无法预测受SMN2拷贝数影响的疾病严重程度。此外，由于本研究聚焦于方法开发和概念验证，样本量较小，尚不足以最终评估假阳性率、假阴性率、诊断敏感性和特异性，以及在全部干血斑相关变异和抑制因素下的稳健性，需在更大临床队列中进一步验证。
研究结论为：本研究开发了一种基于干血斑的STNPCR系统，可在无需DNA提取的情况下检测SMN1纯合缺失。该系统利用干血斑圆片实现简单的单管分析，可降低污染风险并简化常规医院实验室的工作流程。尽管STNPCR系统尚未完全确立为诊断检测方法，但本研究结果表明，基于干血斑的STNPCR系统可为常规医院实验室中疑似SMA患者的评估提供一种简单、廉价且具有实践应用价值的检测手段。该系统可作为新生儿筛查的补充，尤其适用于未接受新生儿筛查的已过新生儿期的有症状患者，有助于缩短诊断延迟，为更多SMA患者争取及时治疗的机会。
