《AAPS Open》：Biologic prodrugs: inactive protein and peptide drugs and drug conjugates with targeted activation
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生物制品已彻底改变了许多疾病的治疗，尤其是罕见病和遗传病，对于这些疾病，小分子药物已显示出有限的疗效，导致过去几十年监管批准数量的激增。尽管取得了这些进展，生物治疗药物仍面临重大挑战，包括复杂的制剂、生产限制以及给药后的安全性和有效性担忧。组织穿透性差、跨生物
生物制品已彻底改变了许多疾病的治疗，尤其是罕见病和遗传病，对于这些疾病，小分子药物已显示出有限的疗效，导致过去几十年监管批准数量的激增。尽管取得了这些进展，生物治疗药物仍面临重大挑战，包括复杂的制剂、生产限制以及给药后的安全性和有效性担忧。组织穿透性差、跨生物屏障吸收减少、环境和酶降解以及快速清除等问题挑战了疗效，尤其是在靶位点，从而增加了脱靶暴露和不良事件的风险。生物前药提供了一种有前景的策略来解决这些局限性，其原理是使生物制品在药理学上保持非活性，直到响应特定的生理或病理信号被选择性激活，从而在靶位点赋予生物活性。本综述讨论了多种生物前药及其激活机制，包括酶触发和环境触发，如pH变化、缺氧、氧化还原电位和外部刺激（例如光）。我们探讨了各种生物前药，包括蛋白质和重组融合蛋白、抗体药物偶联物（ADCs）、聚合物药物偶联物，以及作为掩蔽基序的细胞穿膜肽（CPPs），还有酶前药疗法（EPT）系统，即基因导向酶前药疗法（GDEPT）和抗体导向酶前药疗法（ADEPT）。我们还讨论了溶酶体靶向的生物前药，其利用酸性、富含酶且区室化的溶酶体环境进行受控激活。总的来说，所讨论的实例表明，生物前药作为一个多功能平台，能够选择性地响应生理和环境触发因素，实现对药物激活的增强时空控制，从而限制全身毒性以及与生物制品相关的其他挑战。
引言：生物制品的挑战与前药策略的兴起
生物制品是源自生物体的治疗药物，用于治疗一系列疾病，包括自身免疫、代谢、感染、炎症、内分泌和癌症疾病。尽管生物制品在治疗罕见病和遗传病方面取得了革命性进展，但其开发和应用仍面临多重挑战。首先，生物制品的生产成本高昂且耗时，需要生物表达系统来维持结构和功能完整性，同时降低免疫原性等不良反应的潜在风险。其次，需要复杂的制剂来承受不同给药途径所面临的物理和生理环境。第三，给药后的生理学挑战包括快速肾清除、全身性酶降解、组织穿透性差和脱靶生物活性。这些问题常常使得在预期作用部位难以达到足够的药物水平，而脱靶活性则可能导致剂量限制性毒性和免疫系统激活。
生物前药的概念源于十九世纪中叶对消化生理学的研究，该研究证明胰蛋白酶和糜蛋白酶等强效蛋白酶是以非活性的前酶或酶原形式合成和分泌的，需要受调控的激活以防止对起源组织的自身损伤。二十世纪五十年代末，这一原理被正式扩展到小分子治疗药物，引入了“前药”一词来描述以非活性或低活性形式给药、在体内转化为其药理学活性对应物的化合物。近年来，生物技术和蛋白质工程的进展使得重新探索生物制品作为前药成为可能，包括条件活性酶、掩蔽抗体和前细胞因子。
当代生物前药的结构设计差异很大，并包含化学或生物修饰以增强靶点特异性。化学修饰，如将合成聚合物（例如PEG化）连接到母体生物制品上，常用于小肽和蛋白质以克服循环半衰期短和不稳定问题。生物修饰则涉及保留使生物制品失活的前蛋白前体序列，或将其与载体蛋白（如白蛋白）偶联。连接子可用于桥接独立结构域，维持其独立性，促进结构域间相互作用，实现特异性蛋白质折叠构象，并控制动态细胞环境中的结构域运动。优化的生物前药设计利用独特的生物状态和环境选择性地转化为其活性形式，例如肿瘤和炎症细胞中升高的酶谱或微酸性微环境。
蛋白质前体和融合蛋白前药
非活性蛋白质前体和融合蛋白前药是大分子前药中最常见的类别之一。活性结构域是决定生物前药效力的关键因素，因为它最终赋予治疗效果。掩蔽结构域（通常是载体蛋白）可改善药代动力学、增强组织特异性靶向，并在某些情况下实现受控激活。
酶触发激活
酶触发的蛋白质和融合蛋白前药激活依赖于靶位点的局部酶，如基质金属蛋白酶（MMPs），通过选择性切割前序列或可切割的偶联部分来释放活性蛋白。
胰岛素原-转铁蛋白
重组融合蛋白胰岛素原-转铁蛋白（ProINS-Tf）是一种前药，旨在实现胰岛素肝选择性疗效，同时减轻其不良药代动力学以及低血糖和胰岛素抵抗等不良反应。ProINS-Tf将胰岛素的无活性前序列胰岛素原（ProINS）与转铁蛋白（Tf）融合。该融合蛋白以无活性形式循环，通过Tf-TfR内吞和再循环途径被肝脏酶转化为其活性形式免疫反应性胰岛素-转铁蛋白（ir）INS-Tf。药代动力学分析显示，与ProINS相比，ProINS-Tf表现出改善的系统暴露和延长的循环时间，其消除半衰期（t1/2 elim）为7.29±0.15小时，而ProINS仅为0.50±0.09小时。在体内研究中，ProINS-Tf在链脲佐菌素（STZ）诱导的1型糖尿病小鼠中皮下注射后，通过减少肝脏葡萄糖输出来实现长达40小时的持久肝选择性血糖控制。
白细胞介素
白细胞介素是一类调节免疫细胞生长、增殖和活化的糖蛋白细胞因子，由于其不良药代动力学和潜在全身毒性，已成为前药开发的有吸引力的候选者。白细胞介素-2（IL-2）通过激活NK细胞和各种T细胞亚群，在癌症免疫治疗中发挥关键作用。然而，重组IL-2缺乏选择性受体特异性，导致严重的毒性，包括细胞因子风暴和血管渗漏综合征（VLS）。
ProIL2是一种长效无活性IL-2，旨在刺激位于过表达基质金属蛋白酶（MMPs）的肿瘤部位附近的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）。ProIL-2是一种异源二聚体Fc融合蛋白，其中突变的IL-2结构域与Fc结构域的一个臂融合，另一个臂包含通过MMP可切割序列连接的无活性IL-2受体-β结构域。该前药在MC38荷瘤小鼠中表现出抗肿瘤效果，而没有诱导常规IL-2治疗通常所见的外周IL2Rα/β/γ+复合物受体结合相关的毒性。
Xilio Therapeutics开发的XTX202是一种IL-2前药，目前正在进行临床试验，旨在给药前掩蔽天然IL-2的活性。XTX202包含一个延长半衰期的Fc结构域和一个掩蔽结构域，需要肿瘤微环境中的MMPs进行蛋白水解激活，之后活性形式选择性结合IL-2Rβ而非IL-2Rα。研究表明，激活的XTX202刺激CD8+ T细胞和NK细胞，同时将Treg激活比野生型IL-2降低1000倍以上。在非人灵长类动物中，XTX202每周剂量高达30 mg/kg可耐受，而未掩蔽的IL-2每周最大剂量为0.7 mg/kg，表明掩蔽前药设计在保持精准靶向的同时最大限度地减少了全身毒性。
Werewolf Therapeutics开发的WTX-124是另一种IL-2前药，其设计包括与专有的Fab抗体灭活结构域连接的天然IL-2，该结构域阻断非肿瘤组织中的IL-2活性，以及一个延长前药半衰期的白蛋白靶向抗体。专有连接子仅被肿瘤特异性蛋白酶切割，释放活性IL-2。在同基因肿瘤模型中的体内研究表明，该前药触发T细胞和自然杀伤（NK）细胞活化，导致显著的肿瘤生长抑制。
双功能融合蛋白抗PD-1-proIL2（PTX-912）目前正在进行临床试验，用于靶向治疗癌症，尤其是转移性黑色素瘤和肾癌。它包含与掩蔽的IL-2变体融合的抗PD-1单克隆抗体，设计用于被肿瘤微环境（TME）中的蛋白酶选择性激活。在PD-1耐药小鼠肿瘤模型中，PTX-912在0.1 mg/kg剂量下表现出强效、剂量依赖性的抗肿瘤活性，优于非靶向IL-2类似物。
与IL-2类似，抗肿瘤细胞因子IL-12的临床应用受到严重全身毒性的限制。肿瘤选择性IL-12前药XTX301的开发旨在克服这些限制。其结构包含修饰的IL-12，通过蛋白酶可切割连接子连接，由IL-12Rβ2阻断结构域掩蔽，并与延长半衰期的人Fc部分融合。在肿瘤内通过基质金属蛋白酶激活。与导致体重减轻超过20%的未掩蔽IL-12对照相比，XTX301在非人灵长类动物中达到2.0 mg/kg的最大耐受剂量，表明治疗指数显著拓宽。
干扰素
干扰素（IFNs）是具有强抗肿瘤活性的免疫反应性细胞因子，主要通过调节肿瘤微环境（TME）发挥作用。尽管具有治疗潜力，但其临床应用受到全身毒性和耐受性差的限制。Yam等人开发了IFNα-2b前药，通过肿瘤选择性、蛋白酶可切割的连接子进行位点特异性PEG化，使前药在循环中保持无活性并在TME内被激活。在MDA-MB-231小鼠异种移植模型中，该前药表现出比不可释放掩蔽的IFNα-2b构建体更强的抗肿瘤活性，且耐受性良好。Cao等人设计了ProIFN，一种带有蛋白酶可切割连接子的掩蔽I型IFN-Fc构建体，用于肿瘤内激活。ProIFN表现出增强的肿瘤靶向性、增加的CD8+ T细胞浸润和改善的效应功能，同时提供优越的药代动力学特性和显著降低的全身毒性。
氧化还原敏感激活
细胞还原和氧化（Redox）条件使得蛋白质和融合蛋白前药能够响应并在不同环境中激活，如TME、炎症细胞、高度还原的肝脏环境以及内质网（ER）和胞质溶胶等细胞内区室。Chen等人设计了一种新型体内可切割的二硫键连接子，包含一个含有分子内二硫键和凝血酶敏感序列的二硫环肽，插入转铁蛋白（Tf）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）之间。与Tf连接时，G-CSF在体外细胞增殖试验中表现出降低的生物活性。然而，经凝血酶和还原剂处理后释放G-CSF，释放的细胞因子比单独用凝血酶处理的未切割融合蛋白表现出更大的生物活性。小鼠体内研究进一步表明，经凝血酶处理的G-CSF-环状Tf在给药后经历快速二硫键还原，导致G-CSF结构域与载体分离并将游离细胞因子释放到循环中。
构象变化激活
Regeneron开发的REGN10597是一种条件激活的抗体-细胞因子融合前药，旨在选择性地将IL-2递送至肿瘤浸润T细胞，同时最大限度地减少全身性IL-2毒性。该构建体包含与IL-2融合的抗PD-1抗体片段，并由阻断与IL-2Rα相互作用的抗体片段掩蔽，从而在循环中保持IL-2无活性。在肿瘤微环境（TME）中与PD-1阳性T细胞上的PD-1结合后，诱导构象变化，通过置换阻断IL-2Rα结合的FC片段来解除IL-2的掩蔽。激活的IL-2随后进一步与CD8+效应T细胞和NK细胞上的IL-2Rα结合，触发JAK/STAT信号传导、细胞毒性激活和肿瘤细胞裂解。
聚合物修饰蛋白前药
聚合物修饰的蛋白质前药是通过可切割连接子与聚合物偶联的治疗性蛋白质，这些聚合物作为掩蔽部分，旨在改善其药代动力学和生物活性。常见的聚合物如聚乙二醇（PEG）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）、多糖以及生物相容性、可生物降解的聚合物，通常通过可切割连接子与蛋白质偶联，起到保护蛋白质免受免疫原性、生物降解和快速全身清除的作用。这些连接子被设计为响应生物信号，如pH波动或酶活性，通过水解或蛋白水解实现活性蛋白在靶位点的受控释放。
水解连接子
这类前药通过在生理pH下水解去除掩蔽基团而激活，以缓慢、持续的方式实现一致的激活。TransCon平台采用可逆掩蔽化学。TransCon IL-2 β/γ是一种工程化的IL-2变体，具有选择性IL-2Rβ/γ活性，通过位点特异性偶联至IL-2Rα结合位点工程化半胱氨酸的5 kDa甲氧基聚乙二醇（mPEG）部分实现空间阻断。修饰的IL-2进一步通过自切割连接子瞬时偶联至40 kDa mPEG载体，该连接子在生理pH和温度下自动水解，释放活性IL-2 β/γ。临床前研究表明，其强效激活CD8+ T细胞和NK细胞，选择性扩增CD8+、NK和γδ T细胞，而CD4+ T细胞、Tregs和嗜酸性粒细胞未被激活。非人灵长类动物药代动力学研究显示低Cmax和延长半衰期（>30小时），未观察到细胞因子风暴或血管渗漏综合征。TransCon GH由母体生长激素（GH）通过自动水解连接子瞬时连接至惰性mPEG载体组成。偶联的前药无法与生长激素受体（GHRs）结合，其较大尺寸阻碍肾清除，从而延长半衰期。在生理环境中，去掩蔽发生，活性GH缓慢持续释放，模拟每日GH给药的生物活性。
