《AAPS Open》：Engineering hybrid and synthetic extracellular vesicles for emerging biomedical applications
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天然分泌的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）因其固有的生物相容性、膜复杂性和细胞间通讯能力，作为下一代诊疗一体化平台引起了广泛关注。然而，其更广泛的生物医学和转化应用仍受限于产量低、质量异质性高、制造成本高以及功能工程可控性有限
天然分泌的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）因其固有的生物相容性、膜复杂性和细胞间通讯能力，作为下一代诊疗一体化平台引起了广泛关注。然而，其更广泛的生物医学和转化应用仍受限于产量低、质量异质性高、制造成本高以及功能工程可控性有限等问题。本 mini-review 重点介绍了杂合和合成EV平台如何通过可规模化制造和理性膜工程来克服这些固有障碍。研究人员总结了EV表面功能化的新兴策略，包括化学修饰、生物正交偶联和代谢工程，这些策略能够模块化地安装靶向配体、成像探针和治疗性分子。研究人员进一步讨论了膜伪装纳米系统，其中工程化的单一或杂合膜与功能性纳米材料相结合，以构建性能增强的多功能仿生纳米颗粒。这些进展拓宽了基于EV的系统在药物递送、癌症诊疗、免疫治疗及其他生物医学领域的潜在应用。
主体内容总结
**引言**
细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是细胞分泌至胞外空间的纳米或微米级脂双层包裹颗粒，携带蛋白质、脂质和核酸等生物分子，介导细胞间通讯与分子转移。EVs存在于血液、组织液、脑脊液等体液中，可作为疾病液体活检的生物标志物，并具有作为靶向治疗药物递送平台的潜力。然而，天然EVs产量低、异质性高，制约了其医学应用。EVs的生物发生主要分为两类：外泌体（exosomes）由多泡体与质膜融合后释放，而外泌体样囊泡（ectosomes）则通过质膜直接出芽形成。细菌来源的外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）也构成EVs的重要亚群。EVs的货物组成反映了来源细胞的生理或病理状态，其蛋白质、脂质和核酸成分可调节受体细胞行为，但也带来质量控制与临床应用的挑战。本综述聚焦于杂合与合成EV工程如何应对天然EVs在产量、异质性和生物应用性方面的关键局限，并介绍表面工程化EVs以及膜伪装纳米平台在精准医学和癌症免疫治疗中的前景。
**人工工程化生物活性膜囊泡**
**人工脂质体**
天然来源的膜囊泡具有固有生物学功能，但可控性差、异质性明显且难以规模化生产。相比之下，人工脂质体提供了一种高度可调和可重复的替代方案。通过系统化工程策略，可精确调控脂质组成、膜流动性和表面官能团，构建天然系统难以实现的可编程膜结构。人工脂质体可作为重构平台，通过挤出或超声诱导的膜融合与含有功能性膜蛋白的天然囊泡整合，从而以可负担的工程成本实现功能性囊泡的大规模生产。
**膜重构**
膜重构是构建功能性膜研究、仿生膜工程和治疗性纳米载体系统的核心技术。该方法将膜蛋白从天然细胞环境中提取并重新插入合成脂双层中，提供简化且高度可控的实验平台。然而，实现蛋白质取向的可控和群体水平的均一性仍是挑战。去污剂介导的重构是最常用的方法，但该方法缺乏蛋白质拓扑定向机制，蛋白质插入呈随机取向，且残留去污剂可能破坏膜堆积。为减少去污剂干扰，可在脂质体形成过程中引入膜蛋白，如薄膜水化、反相蒸发和微流体组装。但人工膜重构缺乏活细胞用于精确控制膜蛋白插入和取向的主动调控机制。
**脂质体融合诱导的膜交换**
膜流动性是脂双层动力学的基本理化性质，对膜蛋白结构和功能具有决定性作用。脂质组成是膜流动性和相行为的主要决定因素。1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）因不饱和酰基链和小头基赋予高侧向迁移率并促进负膜曲率；胆固醇则作为流动性缓冲剂增加膜有序性和稳定性。基于这些原理，脂质体融合诱导的膜交换（liposome fusion-induced membrane exchange，LIME）成为一种通过受控脂质混合和膜重塑工程化生物膜的实用策略。高流动性含DOPE脂质体与活细胞接触后，其融合性脂质组分促进直接膜融合和侧向脂质再分布，实现合成脂质体与天然生物膜之间的膜组分交换，同时保留关键膜相关蛋白，生成膜整合脂质体（membrane-integrated liposomes，MILs）。LIME具有简便性和模块化特点，是生产低异质性囊泡系统的可行途径。
**细胞内水凝胶化方法**
除脂双层工程外，细胞内结构操作也被用于调控细胞来源材料的组成和功能。细胞内水凝胶化通过将水凝胶前体引入活细胞，经外部光激活或冷冻触发凝胶化，形成固体细胞内环境。随后通过超声处理等物理破碎方式，可在去除胞质残留的同时富集分离膜相关组分。这些膜富集片段可作为重构囊泡结构的构建模块，为生成保留膜功能且组成可控的细胞来源囊泡提供潜在途径。
**非脂质合成囊泡**
基于脂质体的囊泡在制备成本和长期稳定性方面存在局限，因此非脂质合成囊泡受到关注。这些系统用聚合物、肽或树枝状大分子替代脂双层，其组装主要由交联化学和超分子设计决定。与脂质膜不同，非脂质囊泡通常呈现固定拓扑和受限的侧向迁移性，有助于长时间保持功能组分的空间关系。非脂质囊泡并非替代脂质体作为通用膜模拟物，而是补充脂质系统，优先考虑结构持久性、可重复性和精度控制。然而，其体内安全性和转化面临挑战，包括生物相容性依赖材料的分子量、表面电荷、形态、剂量和降解行为，以及潜在的器官蓄积和长期毒性问题。
**囊泡的表面膜工程**
尽管人工工程化囊泡在组成控制、生产规模、货物封装和功能定制方面具有优势，但其固有结构可能无法完全再现天然EVs的复杂生物界面和功能。表面膜工程因此成为补充策略，以在工程化囊泡上保留生物学相关的膜组分。
**表面化学修饰**
表面化学修饰是最直接的囊泡膜工程方法。该策略利用膜脂质、蛋白质或糖缀合物上天然存在的反应性基团（如氨基、硫醇、羧基和羟基），通过共价或配位相互作用安装所需配体。代表性修饰包括聚乙二醇化以提高胶体稳定性和循环时间，以及偶联靶向配体（如抗体、肽、适配体或小分子）以增强细胞选择性摄取。疏水锚（如脂质尾、胆固醇衍生物或两亲性聚合物）可插入膜中而不显著破坏双层结构。但直接化学修饰可能存在位点选择性有限和偶联效率变异等问题，剧烈反应条件也可能损害膜稳定性并降低生物功能。
货物装载是杂合和合成EV设计的核心考量，装载效率、货物稳定性、囊泡完整性和释放行为共同决定治疗性能。货物可在囊泡形成期间或形成后引入。形成阶段装载适用于亲水性药物和生物大分子，疏水性化合物可掺入脂双层；形成后装载方法提供更大灵活性，但可能导致货物聚集、泄漏或膜破坏。因此，应根据货物理化性质及其与囊泡结构的相容性选择装载方法。
杂合和合成EVs在靶向功能引入方面存在差异。杂合EVs可保留来源细胞的膜蛋白、聚糖和黏附分子，继承同型识别能力，并可通过基因修饰、代谢标记、脂质插入或共价偶联进一步增强靶向性。完全合成囊泡则可更精确地控制配体身份、密度、空间分布和多价性，但可能无法完全再现天然膜的复杂生物识别和免疫调节特性。
**生物正交化学**
生物正交化学源于点击化学概念，由K. Barry Sharpless提出，Carolyn Bertozzi将其发展为可在生命系统中进行而不干扰天然生化过程的反应，特别是无铜应变促进叠氮-炔环加成。生物正交化学具有优异化学选择性，可减少脱靶反应并提高可重复性，适合囊泡和细胞表面工程。其模块化设计使同一膜支架可通过更换偶联组分快速适应不同应用。典型反应对包括叠氮/环辛炔、四嗪/反式环辛烯等，用于将靶向配体、成像探针或治疗性货物安装到膜表面。
**代谢工程**
代谢工程通过重编程活细胞，在囊泡生产前将功能化基团生物合成掺入膜组分，提供一种间接但多功能的表面膜工程途径。细胞在含生物正交或可功能化基序的代谢类似物中培养，这些类似物在正常生物合成过程中被掺入聚糖、脂质或其他膜相关生物分子中。随后从这些工程化细胞获得的囊泡继承修饰的膜组成，支持下游偶联。例如，含叠氮的糖可掺入膜糖蛋白和糖脂，创建用于点击偶联的反应位点。代谢工程还可改变特定膜组分的丰度，以改善靶向、免疫逃逸或与疾病微环境的相互作用。
**使用杂合和合成膜的治疗性纳米系统**
**功能纳米材料**
纳米材料因其可调的物理化学性质而广泛开发用于治疗应用，包括脂质体、聚合物纳米颗粒、介孔二氧化硅纳米颗粒、金纳米结构、氧化铁纳米颗粒等，在药物递送、分子成像、光疗、放疗、催化治疗和免疫调节中具有广泛用途。然而，传统纳米材料面临非特异性蛋白吸附、单核吞噬系统快速清除、病灶部位蓄积差、组织穿透有限以及与复杂细胞微环境相容性不足等生物屏障。
**膜包覆纳米材料**
为克服裸纳米材料有限的生物界面能力，膜包覆纳米系统成为强大的仿生策略。合成纳米核提供治疗和/或成像活性，外层膜作为生物相关界面，改善胶体稳定性、延长循环、降低免疫识别并增强与靶组织的相互作用。膜壳可来源于全细胞膜、细胞外囊泡、脂质体或其他工程化仿生囊泡。膜伪装可保留调控生物分布和细胞识别的膜蛋白、聚糖和脂质，为构建更适应生理环境的纳米药物提供平台。
**杂合膜策略**
单一膜来源可能无法提供最佳治疗性能所需的全部功能，因此发展了杂合膜策略，将两种或以上来源的膜材料整合成多功能膜壳。组合可包括癌细胞膜、免疫细胞膜、红细胞膜、血小板膜、干细胞膜、细菌膜或合成脂质体组分。该方法旨在将不同膜来源的互补特性整合到单一纳米系统中，例如癌细胞膜提供同型靶向，红细胞膜改善循环稳定性，免疫细胞膜增强免疫调节活性。杂合化是从被动膜伪装向主动工程化多功能生物界面转变的重要步骤。
**合成膜整合**
合成膜工程进一步拓展了治疗性纳米系统的设计空间。由确定的磷脂、胆固醇、两亲性聚合物和功能化脂质衍生物组成的人工膜，可在组成、膜流动性、表面化学和批次间重现性方面提供更大控制。合成膜还可纳入靶向配体、刺激响应脂质、聚乙二醇化组分、成像探针和生物正交手柄等功能模块。与天然膜片段结合时，合成膜可形成保留特定生物学功能同时改善可制造性和模块化的杂合生物界面。
**功能化膜纳米颗粒的生物医学应用**
**增强癌症治疗**
膜包覆技术被广泛用于改善体内行为，特别是延长血液循环和降低免疫识别。例如，Ren等报道了负载羟基喜树碱的铜掺杂ZIF-8纳米制剂，进一步包覆聚多巴胺和红细胞膜，表现出延长循环和增强免疫逃逸。针对生理屏障保护的肿瘤部位，Chen等研究了脑微血管内皮细胞膜包覆的聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇载阿霉素纳米颗粒，成功赋予其穿越血脑屏障的能力，通过巨胞饮作用促进纳米颗粒穿透脑组织，实现脑肿瘤靶向药物递送。
近年来，研究者开始利用LIME方法制备源自产电细菌Shewanella oneidensis MR-1的电化学活性膜整合脂质体，并与无机纳米颗粒结合以放大治疗机制。Chen等报道了电化学活性MILs与TiO2纳米颗粒协同系统，通过模拟胞外电子传递增强低剂量X射线照射下超氧阴离子生成。Au@MILs则将该电子调节机制转化为破坏细胞氧化还原过程并诱导细胞死亡的疗法。此外，Wang等将4T1癌细胞膜与细菌外膜囊泡通过膜融合策略结合，构建具有同型肿瘤靶向和免疫激活特性的杂合膜，包覆IR780负载聚合物纳米颗粒，形成超声响应多功能治疗纳米平台。
**感染治疗**
在基础设计层面，细胞膜主要改善体内行为，纳米核提供主要抗菌功能。例如，负载麦角固醇的普鲁士蓝纳米颗粒包覆红细胞膜，利用红细胞膜延长循环和免疫伪装实现感染部位有效滞留，近红外照射下普鲁士蓝核心诱导光热和活性氧介导的抗菌作用。血小板膜包覆的Fe/Zn双金属有机框架则通过血小板膜促进伤口部位蓄积，Fe/Zn双金属核心通过加速Fe(III)/Fe(II)氧化还原循环增强过氧化物酶样活性，实现持续活性氧生成和广谱抗菌。
高级设计中，研究关注感染相关的病理反应。Duan等报道了巨噬细胞膜包覆的多功能树枝状纳米平台，包封多黏菌素B和抗炎剂西维来司他，利用巨噬细胞膜的炎症趋向性增强感染肺部的药物蓄积，同时靶向病原体和宿主炎症反应。骨间充质干细胞膜包覆的纳米平台整合化学动力学疗法与铜死亡，在酸性骨髓炎微环境中实现协同杀菌。
自身免疫疾病主要由免疫失衡驱动，膜基纳米平台可作为生物活性界面直接与免疫细胞和炎症介质相互作用。巨噬细胞膜包覆的氧化铈纳米颗粒可同时清除循环游离DNA、活性氧和促炎细胞因子。中性粒细胞膜包覆的炎症靶向纳米诱饵利用活化中性粒细胞的炎症归巢能力实现病灶优先蓄积。调节性成纤维样滑膜细胞包覆的纳米颗粒利用类风湿关节炎中的同型靶向，选择性蓄积于发炎关节组织并抑制异常免疫激活。
**治疗血管疾病**
动脉粥样硬化治疗中，血小板膜来源的纳米系统利用血小板对受损内皮和炎症斑块的固有黏附性，显著提高载体在病变部位的滞留。血小板膜与合成脂质体组成的杂合纳米结构整合血小板靶向能力与合成囊泡的理化可调性。红细胞-血小板杂合膜包覆纳米颗粒结合延长循环和免疫逃逸，同时维持血管病变靶向，通过生物膜介导的免疫调节降低血小板相关出血风险并精确调控动脉粥样硬化斑块内炎症趋化信号。
血小板膜包覆的聚合物纳米载体已用于抗炎药物递送，通过多层界面工程整合抗炎和抗纤维化功能。免疫细胞杂合膜包覆纳米平台用于治疗自身免疫性心肌炎，通过趋化因子介导的病变归巢和微环境响应性药物释放抑制白细胞浸润。在缺血性脑卒中研究中，血小板膜包覆纳米载体快速蓄积于受损脑血管。
**中枢神经系统和眼部系统**
神经退行性疾病治疗中，细胞膜包覆纳米平台不仅可克服血脑屏障物理限制，还能赋予纳米载体病变识别和神经保护功能。Lei等开发了神经元样细胞膜包覆的姜黄素负载聚合物纳米颗粒，通过微流控方法制备，保留疾病相关表面蛋白，实现对受损多巴胺能神经元的同型靶向，抑制神经炎症、减轻氧化应激并改善线粒体功能。Lin等构建了血小板膜与CCR2过表达细胞膜融合的双靶向脂质体，血小板膜促进与Aβ斑块结合，CCR2介导趋化引导纳米载体趋向炎症区域。
眼部疾病治疗中，Li等开发了视网膜内皮细胞和红细胞膜杂合膜包覆的仿生纳米平台，杂合膜赋予免疫逃逸并作为分子诱饵，呈递膜结合VEGF受体以中和过量血管内皮生长因子。Yang等采用内皮-红细胞杂合膜包覆纳米颗粒靶向受损视网膜血管，减少血管渗漏并部分恢复溶酶体功能。Liu等证实M1巨噬细胞膜包覆纳米颗粒利用巨噬细胞炎症趋向特性增强感染部位药物蓄积、穿透真菌生物膜并中和促炎细胞因子。
**核酸递送**
为克服mRNA的内体滞留，Park等开发了血凝素功能化膜包覆的病毒模拟纳米颗粒，模拟pH触发的病毒膜融合实现高效内体逃逸，显著增强胞质mRNA翻译。Li等采用树突状细胞膜包覆纳米颗粒进行mRNA疫苗递送，利用DC膜的免疫归巢和抗原呈递特性引导基因疫苗产生功能性免疫激活。Cao等报道了巨噬细胞膜伪装的质粒DNA递送平台，通过同型靶向到达感染部位，重编程宿主细胞原位产生抗菌肽，实现从外源药物递送到细胞内遗传编程的概念转变。
对于反义调控，ZIF-8介导的生物矿化结合中性粒细胞膜包覆可稳定反义寡核苷酸，防止循环中酶降解，并通过pH响应MOF解离释放胞质ASOs。Li等引入X射线响应的小干扰RNA递送系统，通过膜介导的屏障穿透与辐射诱导的连接子裂解偶联，实现外部照射在特定位置和时间触发基因沉默，展示刺激响应膜系统在精准基因治疗中的潜力。
**结论**
杂合和合成细胞外囊泡为克服天然EVs的固有局限（如低产量、异质性和高生产成本）提供了有前景的策略。通过整合合成与工程方法，这些平台可实现改进的可扩展性、可控性和功能多样性。表面修饰、生物正交化学和代谢工程进一步拓展了其效用，膜包覆纳米材料和杂合膜系统为多种生物医学应用提供了增强的多功能性。然而，大多数研究仍处于临床前阶段，生物安全性、稳定性、标准化、产量和异质性等挑战尚未解决。未来发展将依赖工程学、化学、医学、材料科学和纳米生物技术的理性整合，以开发安全、有效且可临床转化的仿生囊泡治疗平台。
