《Clinical Cancer Bulletin》：Patient-derived tumor organoid co-culture systems as translational platforms for cancer immunotherapy and precision oncology
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肿瘤微环境（TME）是一个动态且具有免疫抑制特性的生态位，它关键性地调控着癌症进展、免疫逃逸和治疗耐药性。因此，在体外精确模拟肿瘤-免疫相互作用对于推进我们对癌症生物学的理解以及加速开发有效的免疫疗法至关重要。为此目的，共培养系统已成为强大的平台，它能够在明确
肿瘤微环境（TME）是一个动态且具有免疫抑制特性的生态位，它关键性地调控着癌症进展、免疫逃逸和治疗耐药性。因此，在体外精确模拟肿瘤-免疫相互作用对于推进我们对癌症生物学的理解以及加速开发有效的免疫疗法至关重要。为此目的，共培养系统已成为强大的平台，它能够在明确的实验条件下，对肿瘤细胞与免疫、基质或内皮成分之间的细胞串扰进行受控研究。在现有的共培养方法中，患者来源肿瘤类器官与外周血单个核细胞（PDTO–PBMC）共培养系统代表了目前可用的、生理学上最逼真的平台，它保留了原始肿瘤的组织学、遗传和表型异质性，同时能够重建自体免疫反应。这些系统允许以抗原非依赖的方式扩增肿瘤反应性T细胞，为评估多种癌症类型的免疫检查点抑制剂（ICI）、过继细胞疗法（ACT）、嵌合抗原受体（CAR）T细胞构建体以及联合免疫治疗方案提供了一个临床相关的平台。本综述全面审视了从传统2D单层模型到3D球体和类器官平台的肿瘤-免疫共培养系统谱系，批判性地比较了它们的生物学保真度、技术要求以及转化应用价值。特别强调了PDTO–PBMC共培养模型及其在不同免疫细胞群体（包括T细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞和CAR T细胞）中的应用，以及其作为精准免疫治疗功能性伴随诊断工具的潜力。此外，还讨论了当前的局限性、标准化挑战以及未来方向，包括微流控、空间转录组学和人工智能整合。
引言
在细胞培养的早期时代，科学家主要使用2D单层模型，即细胞贴壁生长在平坦表面上，同时悬浮培养相对不占主导地位。这些模型增进了研究人员对肿瘤生物学的理解，并帮助确定了放化疗的最佳条件及新的治疗方法。有证据支持它们在研究转移、药物敏感性或耐药性以及细胞信号传导方面的效用。随着癌症研究的深入，研究重点正逐渐转向3D模型，因为传统的2D系统无法捕捉复杂的肿瘤-微环境相互作用。3D模型能更准确地再现体内肿瘤的结构和行为，包括形态学变化和上皮极性的丧失，以及细胞增殖、基因和蛋白质表达以及治疗反应。一项使用3D MCF10A细胞的研究识别出与乳腺癌进展相关的新遗传依赖性，将该模型确立为生物标志物和治疗靶点发现的有价值的平台。与2D模型相比，3D多细胞肿瘤球体的基因表达谱显示缺氧应答基因上调，而细胞周期相关基因下调。此外，在氧化磷酸化抑制后，静止球体细胞中观察到甲羟戊酸途径活性增强，联合通路阻断降低了球体存活率，这强调了3D模型中抗癌反应的背景依赖性。3D培养可以是同型的或异型的，共培养系统能够实现两种或多种不同细胞类型之间的直接或间接通讯。为了模拟肿瘤免疫微环境，可以将肿瘤类器官（定义为保留关键组织学、遗传和表型肿瘤特征的患者来源3D肿瘤类器官）与免疫细胞和基质细胞共培养。这些系统允许与肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）共培养以研究局部免疫反应，或者与外周血单个核细胞（PBMCs）共培养以重建涉及T细胞、B细胞、自然杀伤（NK）细胞、树突状细胞（DCs）和单核细胞的外周免疫相互作用，从而能够评估免疫识别和抗肿瘤反应。本综述总结了肿瘤类器官-PBMC共培养系统在基础性和转化性癌症研究中的应用。
癌症免疫反应与肿瘤微环境
不受控制的细胞增殖和免疫逃逸是癌症的关键标志，因为T细胞常常无法对肿瘤抗原产生有效反应。TME包含多种免疫抑制成分，包括调节性T细胞（Tregs）、髓源性抑制细胞（MDSCs）以及免疫检查点分子的高表达，并在肿瘤起始、进展和转移中发挥关键作用。除了肿瘤细胞，TME还包括癌症干细胞、基质细胞（脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞）、血管生成血管、细胞外基质（ECM）、信号分子以及多样的免疫群体，如巨噬细胞、DCs、中性粒细胞、NK细胞、B细胞和T细胞。肿瘤-免疫动力学最好通过癌症免疫编辑框架来理解，该框架包括清除、平衡和逃逸三个阶段。逃逸阶段的免疫逃逸使得临床上可检测到的恶性肿瘤成为可能，这强调了TME作为肿瘤进化和治疗耐药性积极驱动因素的作用。TME进一步受到免疫抑制性细胞因子环境的影响，包括TGF-β、IL-10和IL-6，它们抑制T细胞活化并促进MDSC和M2型巨噬细胞的扩增。同时，趋化因子梯度包括CCL22和CXCR4/CXCL12轴积极地招募Tregs和MDSCs到肿瘤部位，同时排除细胞毒性效应细胞，创建空间上有组织的免疫抑制生态位，保护肿瘤细胞免受免疫破坏。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是TME中最丰富且功能上最具可塑性的免疫群体之一。巨噬细胞存在于一个极化光谱上：经典活化的M1型巨噬细胞通过IL-12、TNF-α和活性氧发挥促炎和抗肿瘤作用，而替代活化的M2型巨噬细胞通过分泌IL-10、TGF-β和VEGF促进免疫抑制、血管生成和肿瘤侵袭。在大多数实体瘤中，免疫抑制性TME通过IL-4、IL-13和IL-10信号将TAMs推向M2表型，将一个潜在的抗肿瘤免疫群体转化为肿瘤进展和治疗耐药性的积极推动者。TME介导的免疫抑制的一个关键后果是免疫排斥。肿瘤被分类为炎症型（“热”）、免疫排斥型或免疫沙漠型（“冷”），后两者在很大程度上对免疫疗法无反应。结缔组织增生性间质和检查点配体的上调进一步损害了免疫浸润和T细胞功能，这为基于类器官的共培养系统提供了关键的理论依据，该系统保留了空间和基质的肿瘤复杂性。免疫逃逸的核心是利用检查点通路。肿瘤细胞上的PD-L1与T细胞上的PD-1结合，诱导T细胞耗竭，其特征是增殖、细胞因子产生和细胞毒性降低，而CTLA-4通过与CD28竞争B7配体来削弱T细胞启动。新兴的检查点包括LAG-3、TIM-3和TIGIT进一步促进了瘤内T细胞耗竭，并代表了下一代免疫疗法的靶点。在患者来源的共培养系统中模拟这些通路为评估检查点抑制剂疗效提供了一个个性化平台。
癌症免疫疗法
免疫疗法利用或改造免疫系统，使其更有效地识别和消灭癌细胞。T细胞在此过程中处于核心地位，它们识别肿瘤特异性抗原、增殖并产生记忆反应，并且对于过继细胞疗法（ACT）和免疫检查点抑制剂（ICI）疗法至关重要。ACT涉及回输活化的T细胞，包括TIL疗法（其中TILs被分离、体外扩增并重新引入）和CAR T细胞疗法（其中患者的T细胞被工程化以表达靶向肿瘤抗原的受体，然后再回输）。免疫检查点是癌症或免疫细胞表达的蛋白质，可抑制抗肿瘤免疫。ICI疗法阻断这些检查点，恢复T细胞的细胞毒活性，其中PD-1/PD-L1和CTLA-4是最具临床相关性的靶点。ICIs已在多种恶性肿瘤中显示出疗效，包括非小细胞肺癌（NSCLC）、尿路上皮膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌、乳腺癌、皮肤鳞状细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌和霍奇金淋巴瘤。研究TME动态和对免疫疗法的敏感性需要在培养的癌症系统内存活的功能性免疫细胞，这可以通过共培养模型和TIL扩增来实现。
用于癌症研究的体内和体外模型
体内异种移植模型
异种移植模型将癌细胞移植到免疫缺陷小鼠体内。虽然方便，但标准细胞系很难重现天然的TME和肿瘤异质性。患者来源异种移植（PDX）模型通过植入患者肿瘤来解决这个问题，避免了免疫排斥，使用新鲜或冷冻组织作为细胞悬液或小的组织片段。悬液增加了异质性但降低了活力，而片段更好地保留了组织结构及TME相互作用。植入可以是原位移植，保持天然解剖结构和转移潜能，也可以是异位移植。几种免疫缺陷小鼠品系有助于异种移植，包括无胸腺裸鼠（由于Foxn1缺失导致T细胞缺陷）、严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠（由于Prkdc突变导致B细胞和T细胞成熟受损）、NOD/SCID小鼠（额外的NK细胞缺陷和补体缺失）以及NSG小鼠（由于额外的IL2Rγ缺失导致严重的B细胞、T细胞和NK细胞缺陷）。PDX模型保留了肿瘤的形态、组织学和遗传特征，同时允许足够的生长用于实验分析。主要的局限性包括建立时间长、可变植入率、人源基质逐渐被鼠源基质取代、无法评估免疫介导的疗法以及有限的转化适用性。
体外培养模型
2D癌细胞培养因其易于处理、扩增和保存而被广泛使用，并且可以与免疫成分（如PBMCs）共培养以部分模拟免疫相互作用。然而，2D模型缺乏组织结构及准确的细胞间相互作用，并且经常获得影响增殖、形态和转移行为的遗传改变。3D模型，主要是肿瘤球体和类器官，能更好地重现肿瘤结构、异质性、分化和微环境相互作用，提供更具生理相关性的研究平台。2D与3D模型的主要特征、优势和局限性已得到总结。
球体模型
球体是由单细胞悬液自组装形成的3D微组织，通常直径在200–500 μm之间，具体取决于培养平台和接种密度。与2D培养不同，细胞彼此粘附而非粘附于基底，形成由整合素（促进ECM附着）和钙黏蛋白（实现细胞间粘附）介导的球形结构。球体形成经历三个阶段：通过整合素-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）相互作用进行初始细胞聚集，同时钙黏蛋白表达上调；钙黏蛋白在细胞膜上积累；以及通过同嗜性钙黏蛋白相互作用稳定下来。常见的球体生成技术包括：(1) 沉淀培养，利用离心力促进聚集，但大的球体可能发展出缺氧核心；(2) 悬滴培养，表面张力和重力驱动球体形成，但实时监测有限；(3) 液体覆盖培养，使用非粘附涂层（如琼脂糖或聚HEMA）促进细胞间粘附，透明质酸等聚合物支持细胞信号传导；(4) 搅拌培养，持续搅拌可实现可扩展的异型球体生产，但需要仔细控制速度。球体能有效重现肿瘤结构、细胞间和细胞-ECM相互作用以及信号通路。与免疫细胞（如PBMCs）共培养可以模拟肿瘤-免疫相互作用和瘤内异质性，使球体成为一种有价值的临床前研究工具。
类器官模型
类器官是自组织的3D体外模型，常被称为“微型器官”，通过谱系定向和空间细胞分选，在ECM和培养基信号的引导下，重现原生组织的结构和功能。这种能力使得能够在多种癌症类型中生成患者来源肿瘤类器官（PDTOs），包括结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌和脑癌等。类器官的生成依赖于多种方法，其中基于ECM的平台最为常见。这些包括天然ECM、人源或脱细胞基质、合成水凝胶以及结构化支架。这些系统在补充有生长因子的特定培养基中培养肿瘤细胞，产生的肿瘤类器官保留了源肿瘤的突变谱、组织病理学和细胞多样性。尽管存在批次间差异，基于Matrigel的系统由于其可用性和标准化流程而仍然是最广泛使用的。主要的局限性包括ECM重现性问题、缺乏基质、血管和免疫成分，以及实验室间在培养基组成和处理方面的一致性不足。
先进的类器官技术
最近的创新旨在提高类器官系统的生理相关性和转化潜力。生物工程合成的ECM平台提供了可调的刚度、孔隙率和生化信号，具有改进的重现性和可扩展性，但成本和复杂性更高。微流控芯片器官系统能够实现灌注、血管化的类器官，模拟流体流动、营养梯度和免疫浸润，但在通量和标准化方面存在局限。多组学、活细胞成像和人工智能驱动分析的整合支持动态监测和预测性精准肿瘤学建模，但需要先进的计算资源。气液界面（ALI）培养保留了上皮、基质和免疫成分，并改善了氧气供应，但免疫细胞随时间推移的丢失和缺乏血管化仍然是局限性。其他平台包括微孔阵列、液滴封装和声学聚集，能够实现高通量、尺寸可控的类器官生产，并具有增强的重现性，但通常仅限于短期培养。总的来说，这些创新扩展了类器官的实用性，但在生理复杂性、可扩展性、成本和标准化之间存在权衡。
基于免疫细胞的共培养模型
T细胞
PDTOs可以与免疫细胞共培养，以研究肿瘤-免疫相互作用并评估免疫疗法疗效。通过TILs或PBMCs引入的T细胞是这些系统的核心。ALI培养的PDTOs保留了复杂的TME成分，包括实质、间质和有功能的TILs，能够实现内在免疫反应的体外建模，而外周免疫细胞则可通过基于Matrigel的共培养进行研究。PDTO–PBMC系统中的“自体免疫重建”一词需要精确定义。功能性免疫重建需要证明抗原特异性T细胞识别，证据包括HLA依赖性的肿瘤类器官杀伤（而非匹配的健康类器官）、作为肿瘤反应性T细胞活化标志物的CD137（4-1BB）上调、干扰素-γ（IFN-γ）分泌和颗粒酶B介导的细胞毒性，这与仅仅是免疫细胞和肿瘤细胞的物理共存不同，后者并不构成功能性重建。Dijkstra等人的里程碑式研究确立了这一区别，他们证明了PDTO–PBMC共培养扩增的CD8+ T细胞能杀死肿瘤类器官，但保留健康组织来源的类器官，杀伤效率因肿瘤类型而异，范围为20%–80%，并通过HLA阻断实验证实了抗原特异性。随后在胰腺癌中的研究表明，类器官引发的T细胞通过颗粒酶B和Fas–FasL依赖途径介导细胞毒性，同时伴有组织驻留记忆T细胞标志物的表达，这为真正的免疫重建而非旁观者细胞毒性提供了机制验证。检查点阻断反应性已在免疫增强的PDTO平台中得到验证，在这些平台中，抗PD-1处理共培养物增加了CD3+和CD8+ T细胞的募集和裂解的caspase表达；在ALI模型中，类器官对PD-1/PD-L1阻断的反应在大约85%的病例中与临床结果相关。总之，这些研究定义了功能性自体免疫重建的最低标准：HLA限制的肿瘤选择性杀伤、活化标志物上调以及对检查点调节的反应性——所有这些都必须在一个被认为经过功能验证而非仅仅共存的PDTO–PBMC系统中得到证明。最简单的方法是将免疫细胞直接添加到培养基中，允许细胞因子介导的相互作用，但直接接触有限；降低Matrigel浓度可以改善细胞接触。或者，将解离的类器官与PBMCs在IFN-γ刺激和共刺激信号（抗CD28/抗PD-1）下共培养，可以实现肿瘤反应性T细胞的扩增和患者特异性的细胞毒性评估。对于长期研究，预涂Matrigel的培养板或低百分比Matrigel培养基可增强系统稳定性并促进直接的免疫-肿瘤相互作用。这些平台已经模拟了MDSCs促进类器官生长同时抑制T细胞激活的过程，重现了免疫抑制性TME并为治疗评估提供了信息。
成纤维细胞和内皮细胞
癌症类器官和球体可以与成纤维细胞、内皮细胞和干细胞共培养，以研究TME相互作用。癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过直接接触、可溶性因子、细胞外囊泡和基质重塑来调节肿瘤生长、干性和化疗耐药性。
