《Discover Plants》：Deciphering abiotic stress resilience in crop plants through multiomics insights and CRISPR Cas9 mediated genome editing
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非生物因素，如干旱、盐分、极端温度和重金属毒性，持续威胁全球农业生产，导致主要粮食作物产量损失估计达40–70%。干旱使水稻减产高达50%，大豆减产42%，玉米减产40%，小麦减产21%，鹰嘴豆减产27–40%；而土壤盐碱化影响了近20%的灌溉农业区，同样导致
非生物因素，如干旱、盐分、极端温度和重金属毒性，持续威胁全球农业生产，导致主要粮食作物产量损失估计达40–70%。干旱使水稻减产高达50%，大豆减产42%，玉米减产40%，小麦减产21%，鹰嘴豆减产27–40%；而土壤盐碱化影响了近20%的灌溉农业区，同样导致生产力下降。类似地，温度极值和重金属毒性加剧了氧化胁迫，阻碍养分吸收，扰乱细胞稳态，从而抑制植物生长和发育。基因组学（Genomics）和蛋白质组学（Proteomics）分析已能够系统性地鉴定和功能表征胁迫响应基因（例如OsPYL9、AtWRKY8）和调控蛋白，包括热休克蛋白70（HSP70）和谷胱甘肽转移酶（glutathione transferase），这些因子介导胁迫感知和下游适应性信号级联反应。基于CRISPR的基因组编辑通过靶向参与非生物胁迫耐受性的关键基因（细胞分裂素氧化酶基因OsCKX2），为开发气候适应性作物提供了一种精确且有前景的方法，为在不断变化的环境条件下实现可持续作物改良提供了潜力。本研究评估了基于CRISPR/Cas9的基因组编辑用于胁迫耐受性的现状，重点阐述了农业植物中非生物变量的分子和调控基础。此外，预计基因组编辑技术（如CRISPR-Cas9）和高分辨率蛋白质组学方法的进步将为精准农业性状改良提供新的选择，从而加强育种计划并助力确保粮食安全的全球努力。
1 引言
植物因其固着生活方式，在整个生命周期中需承受高盐浓度、重金属毒性、干旱条件和温度变化等多种胁迫。这些胁迫条件会在基因组水平触发植物变化，有助于植物的生存。不同基因的激活和不同蛋白质的形成帮助植物在胁迫条件下生长。“组学”（omics）指结合细胞学、分子系统和计算生物学方法，评估不同生物群体间生物学数据的功能与联系。基因组学（Genomics）、蛋白质组学（Proteomics）、转录组学（Transcriptomics）、代谢组学（Metabolomics）、表观基因组学（Epigenomics）、生物信息学（Bioinformatics）、蛋白质基因组学（Proteogenomics）、脂质组学（Lipidomics）、离子组学（Ionomics）、相互作用组学（Interactomics）和表型组学（Phenomics）等多组学技术提供了丰富的信息，用于理解植物在胁迫条件下的生理过程及其应对不利影响的挑战性途径。整合来自基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等多个层面的数据，可以实现对复杂生物学过程的全面理解，并识别植物非生物胁迫耐受性响应中的关键分子操作因子。非生物因子诱导生理、生化和分子水平的显著变化，损害植物生长发育。作为响应，植物激活复杂的调控网络，如转录因子、胁迫响应蛋白和信号通路，以维持细胞稳态并增强胁迫耐受性。近期在全基因组鉴定和组学方法方面的进展，使得鉴定参与极端环境适应的关键胁迫响应基因、蛋白质和代谢物成为可能。这些策略为了解胁迫耐受性的分子机制提供了基础性见解，并通过分子育种和创新促进了环境友好型作物品种的开发。
2 植物干旱响应
干旱是最具破坏性的非生物刺激之一，严重降低植物的生长、发育和产量。为防止水分流失，植物关闭气孔，这抑制了CO2吸收，降低了光合作用速率，并阻碍了生物量形成。水分短缺还通过减少蒸腾作用和干扰木质部与韧皮部功能来干扰养分吸收和运输，改变养分稳态，包括磷和氮代谢。此外，光系统I和II、叶绿素、类胡萝卜素以及卡尔文循环酶均受胁迫影响，从而损害光合作用机制，减少淀粉合成和碳吸收。干旱胁迫会触发一个由调控性和功能性蛋白组成的复杂网络，共同提高作物的生存能力和适应性。干旱响应基因的表达受到蛋白激酶、磷酸酶、转录因子（AREB、DREB2、MYB）以及与ABA相关的调控等调控元件的监控。这些信号通路触发功能性蛋白的合成，包括渗透调节酶、用于活性氧清除的解毒酶、蛋白酶和分子伴侣，以维持细胞稳态并增强对干旱的耐受性。现代基于组学的育种技术的应用已经改变了作物改良方式，实现了对所需性状的准确有效选择。
2.1 干旱耐受下的基因表达
不同植物中特定基因的表达有助于干旱耐受，因为细胞分裂素、生长素、乙烯、赤霉素、脱落酸（ABA）等不同激素以及一氧化氮（NO）等信号分子的形成及其在干旱期间的相互通讯有助于调节干旱状态。赤霉素通过调节糖类、抗氧化剂和渗透保护剂，帮助激活在胁迫下发挥作用的多种激素，使植物能够在脱水条件下继续生长。乙烯与茉莉酸和ABA等激素相互作用，协助调节干旱胁迫。生长素、乙烯和细胞分裂素等激素也在胁迫管理中发挥作用。过表达CKX1、CKX2、CKX3和CKX4基因可降低细胞分裂素含量，增强对干旱胁迫的耐受性。在大豆中，过表达导致脯氨酸合成的AtP5R基因有助于提高干旱耐受性。在水稻中，增加由AtEDT1/HDG11基因编码的蛋白质浓度可提高水分利用效率。甘氨酸甜菜碱（GB）与锌和水杨酸一起有助于提高玉米的干旱耐受性和产量。甘露醇生物合成基因导致甘露醇-1-磷酸脱氢酶蛋白的产生，可改善小麦等作物的盐分和干旱胁迫。通过鉴定供体、作图以及利用标记辅助育种定位影响胁迫下性能的数量性状位点（QTLs）和基因，结合传统育种、分子遗传学、基因组学和低成本表型分析项目，现在可以获得培育高产耐旱品种的完整范围。
2.2 与干旱耐受相关的关键蛋白
蛋白质组学方法提供了新型植物生物技术工具，强调了其作为作物改良重要生物技术工具的潜力。二维凝胶电泳（2-DE）、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和差异凝胶电泳（DIGE）等不同蛋白质组学技术已被用于发现参与干旱胁迫管理的各种蛋白质。肌动蛋白通过增加肌动蛋白丝密度来修复干旱损伤的膜，从而保护植物免受干旱侵害。S-腺苷甲硫氨酸合成参与抵御干旱胁迫。同型半胱氨酸、甲基转移酶、氨基酰化酶-1和半胱氨酸合酶等蛋白质在鹰嘴豆干旱条件下表现出更高的聚集度。比较研究中，在鹰嘴豆和水稻中鉴定出几种提供抗旱防御的蛋白质，例如乳酰谷胱甘肽裂解酶、p23蛋白和Kunitz蛋白酶抑制剂。干旱胁迫下鹰嘴豆的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素显著减少。许多作物在干旱期间hsp70和hsp90蛋白浓度降低。光合作用和信号通路的几种蛋白质也在减轻干旱胁迫中发挥作用。在珍珠粟中发现光呼吸的氨甲基转移酶蛋白似乎在干旱管理中很重要并被上调。
3 温度胁迫响应
高温和低温胁迫等极端温度条件可能在植物生长发育的关键阶段产生有害影响。冷胁迫是指植物面临约0–15°C的非冻结温度时发生的状况。热胁迫改变影响植物生理生化过程的分子系统，因此快速升温是有害的。较高温度阻碍作物发育并降低种子萌发。此外，高温的负面后果因热胁迫的时长和强度以及作物的生长阶段而异。在水稻中，热胁迫已被证明会减少穗数或小花数，并通过降低蛋白质和淀粉浓度来降低产品质量。低温和冷胁迫也影响植物的生理生化过程，进而影响产品质量和产量。降温会导致原生质流动、膜破裂和电解质渗漏。冻结温度影响呼吸作用、代谢、光合作用和矿物质吸收。植物中响应低温胁迫的与多种低分子量蛋白质合成相关的基因转录发生变化。然而，植物具有非凡的耐温能力。耐热性是指所有能处理高温的植物，近年来，基因组和蛋白质组范围的研究的进展为科学家理解响应温度的复杂适应系统铺平了道路。
3.1 温度胁迫相关基因的表达
通过RNA印迹杂交、微阵列和定量PCR观察到了非生物胁迫诱导的基因表达。拟南芥的RD29A/COR78/LTI78等基因在保护细胞免受脱水方面发挥作用。脱水响应元件（DRE）是一个9 bp的保守区域，已被确定为在脱落酸非依赖性冷响应中控制RD29A激活的关键顺式作用元件。冷胁迫增加DREB1/CBF基因的表达。与冷相关的转录因子是三种DREB1蛋白。在热胁迫场景中，DREB2A蛋白受到额外降解途径的调节。响应热胁迫，酪蛋白激酶1（CK1）通过阻止NRD中的磷酸化来锚定并激活DREB2A。拟南芥中发现的三个DREB1/CBF基因分别是DREB1B/CBF1、DREB1A/CBF3和DREB1C/CBF2，它们负责温度胁迫耐受性。具有三个被破坏的DREB1基因的拟南芥突变体植株表现出降低的冷冻耐受性。植物使用两种不同类型的信号来识别冷胁迫：快速或缓慢的温度下降。当温度快速下降时，钙调蛋白结合转录激活因子（CAMTAs）通过强烈诱导DREB1B和DREB1C的表达来响应。当ShDHN基因被过度强调时，观察到具有去垢剂和分子伴侣样特性的蛋白质聚集，从而导致耐冷性提高。过表达LeAN2基因导致花青素生物合成途径中多个结构基因的上调，导致花青素聚集，增强了耐热性。AtGRX基因赋予番茄植株抵抗冻结温度的能力，并负责维持细胞氧化还原稳态。
3.2 温度胁迫下的蛋白质调控
分析了高温期间热休克蛋白（HSPs）合成的诱导。随着温度过高，具有分子伴侣功能的蛋白质（包括HSPs和小HSPs）的表达增加。暴露于12–24小时的热量后，与野生植物相比鉴定出了48种蛋白质。其中被证明是HSPs的18种蛋白质包括Cpn60、HSP70、HSP100、smHSPs以及dnak型分子伴侣结合免疫球蛋白蛋白（BiP）。还报道了谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、超氧化物歧化酶（SOD）的叶绿体前体和硫氧还蛋白h型（Trx h）等酶的参与。冷驯化是指植物在低温下对冰冻的改善性抵抗力。它显示了基因和蛋白质以及代谢副产物的进一步改变表达。在低温下检查拟南芥蛋白质组时发现了38种蛋白质。当水稻花药在4–7pH条件下暴露于12°C的低温48小时时，发现了70种蛋白质。在线粒体蛋白质组水平上对豌豆进行研究时发现了33种蛋白质，其中20种负责几天内4°C下的冷胁迫。在大豆4°C冷胁迫下报告了25种蛋白质。在低温下，在水稻鞘中鉴定出了12种N-糖基化蛋白。在水稻植物中，HSP70降解，并且植物中负责冻胁迫的豆血红蛋白（LB-a）浓度较低。在低温下，LB-a可能与冷胁迫引起的叶绿体分解有关。在耐冷过程中观察到菊苣根中Cu超氧化物歧化酶（SOD）和Zn SOD的增加。植物具有增强精氨基琥珀酸尿症（ASA）和谷胱甘肽（GSH）代谢的酶。在冻害期间，抗冻蛋白（AFPs）在植物成熟及其维持中发挥主要作用。小麦等作物在其质外体中积累AFPs以耐受高温胁迫。蛋白质水解、能量储存、活性氧清除、蛋白质折叠以及碳水化合物、蛋白质和核苷酸的生成都与冷敏感蛋白有关。
4 盐分胁迫响应
盐分引起渗透和氧化胁迫，影响植物产品的生产力。Na+和K+离子是导致盐胁迫的两个主要因素。到2050年，由于盐渍化，大约30–50%的耕地将会丧失。通过基因工程恢复作物高盐浓度是控制全球盐分问题的有力工具。在幼苗期，盐分胁迫可能改变渗透稳态、光合作用、代谢、信号转导、能量生产和转移。一些植物生理学家在蛋白质组水平上研究了盐分胁迫下的模式植物和作物。盐胁迫的负面影响在植物根部观察到，发现盐胁迫响应基因更多地诱导植物根部而非地上部分。HSP70、谷胱甘肽转移酶和甘露糖结合水稻凝集素的表达增加，而ATP合酶β链和氢化酶的表达水平下降。胁迫导向信号传导（SOS）转录基因家族被认为是刺激离子稳态最有效的胁迫响应基因家族之一，从而赋予耐盐性。盐胁迫触发拟南芥中AtWRKY8基因频繁表达，该基因直接结合RD29A启动子。通过转录谱分析筛选出盐分胁迫期间上调和下调的特定基因。一个称为SERF1的盐响应转录因子基因在水稻中表现出在用盐和H2O2处理后根特异性激活。水稻盐胁迫响应研究受OsRMC负调控，该基因编码一个受体样激酶。
4.2 与盐分胁迫相关的蛋白质调控
对遭受盐分的34种不同植物物种进行了蛋白质组学研究。发现了2171种在高盐浓度下响应的蛋白质。在红树（一种盐生植物）中发现了23种盐响应蛋白；10种不同的蛋白质负责光合作用、细胞组织和蛋白质折叠。由于蛋白质折叠和降解相关蛋白表达增加，红树能够在无法忍受的盐胁迫条件下存活。在水稻植物中，在盐分条件下发现四种盐诱导的晚期胚胎发生丰富（LEA）蛋白增加并在刺激消除后分解。来自大麦的HVA1（一个LEA蛋白基因）被引入水稻以获得更好的生长。这表明LEA蛋白相关基因可用于胁迫条件下的作物改良。分子伴侣帮助蛋白质折叠并防止错误折叠，例如肽基脯氨酰顺反异构酶和钙连蛋白（一种钙结合蛋白）在高盐浓度下过表达。在大豆中鉴定出LEA蛋白在高盐胁迫下表达。
5 植物对重金属胁迫的响应
过去几年，土壤中重金属（HM）浓度的增加是备受关注的胁迫之一。重金属显示金属特性，原子质量大于20，比重超过5。它们分为必需元素和非必需元素两类。必需元素在任何植物的代谢活动中都起着基础性作用，而非必需元素不参与植物的任何代谢活动。必需元素如硼、铜、铁、钼、锰和锌的特定量是完美植物生长发育所必需的；其过量会造成胁迫和氧化损伤。重金属浓度的增加影响种子质量和发育。砷、镉、铅和汞等非必需元素浓度过度增加会降低作物生产力。基因组学和蛋白质组学方法在阐明植物胁迫响应和作物改良中发挥着必要作用。
5.1 参与重金属胁迫耐受性的基因
分析方法经常与计算工具、方法和数据库相结合，以鉴定影响HM稳态、运输、区室化转运和螯合的关键基因。在一次此类尝试中，从水稻中发现了46个HM相关蛋白（HMPs），从拟南芥中发现了55个。这些HMPs上的两个半胱氨酸残基结合HMs，促进其运输和解毒。HMA对于HM的吸收、易位和区室化至关重要。在另一项研究中，通过全基因组鉴定含有HMA结构域的土豆基因，发现了36个展示不同基因结构的基因。
5.2 金属毒性下的蛋白质表达
基因组学监测转录水平的变化，这与蛋白质表达相关。糖基化、磷酸化、SUMO化和泛素化等转录后水平调控调节蛋白质表达。目前，由于涉及蛋白质鉴定和分离技术的进步，在阐明植物重金属毒性分子机制方面做出了大量努力。在胁迫条件下进行了一些蛋白质组学研究。为了管理重金属毒性，植物已经发展出有效的机制来合成有毒金属的结合蛋白。
6 CRISPR/Cas介导的非生物胁迫耐受性
基因组编辑是用于创造强健作物的众多新兴遗传技术之一，然而对其种植的严格法律仍然是基因组编辑作物推广的主要障碍。基因组编辑检测的进步，如成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR），使得能够精确修改基因组。基因组编辑可用于研究新性状和增强性状以减轻非生物胁迫的影响。研究表明CRISPR/Cas9基因组编辑系统可以轻松建立在作物上，并且在胁迫耐受性方面具有巨大潜力用于作物基因组的靶向操作。小麦原生质体CRISPR/Cas9基因组编辑系统用于特异性修饰胁迫响应转录因子的基因。CRISPR/Cas9创建的OsAnn3敲除突变体与野生型植物相比具有增加的相对电导率，表明OsAnn3可以有助于水稻的耐冷性。水稻OsAnn5启动子区域具有许多常见的顺式调控启动子元件。当使用CRISPR/Cas9消除OsAnn5功能时，水稻在冷胁迫下苗期的存活率大大提高，这表明OsAnn5控制水稻苗期的冷胁迫耐受性。基于CRISPR/Cas9的编辑针对包括干旱、盐分、高温、寒冷和重金属胁迫响应基因在内的非生物胁迫。由于CRISPR-Cas系统易于使用、高效、高度精确且可多重化，它彻底改变了作物育种，并为下一代育种打开了大门。迄今为止，只有少数研究证明了CRISPR-Cas系统在作物植物非生物胁迫耐受性方面的弹性和适应性。CRISPR/Cas9与下一代测序技术相结合，有潜力帮助设计未来作物并减轻气候变化对世界粮食生产的不利影响。脱靶效应是基因组编辑研究中的主要问题之一。当前的技术可能效率低下，并常导致转基因随机整合。更新的技术，如电穿孔和核糖核蛋白（RNP）递送，似乎有可能更有效和准确地分配基因组编辑组件。基因组编辑技术在作物改良中的应用可能会获得监管许可，但这因国家而异，并且可能是一个耗时且昂贵的过程。尽管CRISPR/Cas为基础的作物改良有望提高非生物胁迫耐受性，但仍面临诸多挑战，如脱靶突变和无意的基因组改变，可能影响植物性能和基因组完整性。此外，基因编辑可能导致权衡和上位效应，其中增加的胁迫耐受性可能与生长、产量或其他农艺性状的下降相关联。基因调控网络的复杂性、上位互作和遗传背景进一步限制了修饰表型的可预测性和可重复性。技术限制仍然是重大障碍，如基因型依赖的转化和再生效率、多重编辑的复杂性，以及需要全面的分子和多组学验证。此外，基因型与环境互作以及复合胁迫条件可能导致受控条件下的表现无法转移到田间环境，这凸显了对多地多季节田间验证的需求。CRISPR编辑作物的广泛采用还受到生物安全问题、潜在基因流、监管差异、公众接受度和知识产权挑战的影响。
7 基于机制的气候适应性品种设计
利用多组学和基因组编辑方法，已经实现了从描述性育种向基于机制的耐候品种生产的转变。印度Pusa Rice DST1和DRR Dhan 100（Kamala）的出现是一个例子，说明对气孔和激素调控网络的靶向修饰可以同时提高生产力和胁迫耐力。DRR Dhan 100携带一个由CRISPR/Cas9创建的新OsCKX2等位基因，该等位基因降低细胞分裂素降解并维持生殖组织中较高的细胞分裂素水平，从而促进分蘖、籽粒数量和提早成熟，同时在低投入和干旱条件下保持性能。另一方面，在Pusa Rice DST1中，胁迫响应的负调控因子DST被敲除。这导致蒸腾作用降低、气孔密度减小和水分利用效率提高，以及在盐胁迫下分蘖增加和离子稳态改善。这些基因组编辑变体得到了标记辅助和基因组辅助品种的补充，这些品种展示了如何通过QTL堆叠将渗透调节、离子排除、淹水生存和病原体免疫整合到优良背景中，提供无产量损失的多重胁迫耐受性。类似的概念正在全球范围内通过小麦、玉米和大豆中的CRISPR编辑和多组学指导育种得到应用，其中乙烯、ABA和热休克通路的修饰已经产生了在干旱和高温下保持或提高产量的品种。总的来说，这些例子强调了基于组学信息、基于机制的编辑和标记辅助渐渗为开发新一代品种提供了一个强大的框架，这些品种不仅产量更高，而且内在具有应对气候变化带来的多方面胁迫的韧性。
8 结论
总体而言，组学技术通过提供影响非生物胁迫响应的复杂分子网络的系统性知识，彻底改变了植物胁迫生物学。整合新开发的多组学方法，如基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学，已经定义了参与胁迫监测、信号转导和适应性生理反应的基因、蛋白质和代谢物的多方面调控。研究人员预测，上述技术在农业领域的应用可以提供改良的作物产量，以满足第二次绿色革命中对食物的需求，这可能满足不断增长人口的粮食需求和确保营养安全。为了满足全球特别是发展中国家的蔬菜需求和营养安全，必须利用机会增加作物的生产。未来的研究应侧重于将多组学技术与人工智能驱动的分析相结合，以预测和提高植物胁迫耐受性，并确保全球不断增长人口的粮食安全。未来的研究应集中于将多组学信息与表型组学、人工智能和精准育种相结合，将实验室发现转化为能够恶劣气候条件下维持农业生产的耐候作物。国家和国际基因组编辑序列数据库的建设对于透明度、可追溯性以及遵守国际贸易规则至关重要。这些数据库将为监管机构、研究人员和政策制定者提供可靠的分子信息，促进基于技术的决策。此外，发展机构能力和培训监管研究人员对于基因组编辑作物的长期可行性至关重要。单细胞基因组学和先进的机器学习技术等新技术有望提高对作物分子动力学的理解。单细胞方法将能够剖析不同组织中细胞类型特异性的响应，而人工智能将促进复杂多组学数据的整合和理解。此外，预计高分辨率蛋白质组学方法和基因组编辑工具的发展将为精准作物性状操作提供新的机会，加速育种计划并支持确保粮食安全的全球努力。
