中试沼气厂启动阶段微生物群落评估

《Folia Microbiologica》：Assessment of microbial community in the startup process of a pilot biogas plant

　　

摘要

沼气生产是将大量废弃物生物转化为生物能源的策略之一，是减少温室气体的替代方案之一。宏条形码分析旨在从工艺启动之初了解微生物群落在沼气生产成功中的作用。本研究比较了一座利用有机固体废弃物和海关查获有机产品生产车用沼气的中试工厂在静止期（SP）、启动期（IP）和批量期（BP）的微生物多样性和代谢预测。在14天运行期间（IP），日产量为126 Nm³/天。在BP阶段，产量达到207 Nm³/天，甲烷回收率为65%。拟杆菌门（Bacteroidota）和厚壁菌门（Firmicutes）占优势（BP阶段占47%），并与水解和产酸过程相关。DMER64与氢营养型古菌、甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）和Candidatus Methanofastidiosum共同占优。与氢营养代谢及CO₂还原为CH₄相关的基因在运行初期阶段表现突出。进料制度和底物组成等因素可能影响了细菌群落以及特定古菌属的筛选，进而影响工艺过程。理解微生物群落与理化参数的关系有助于控制可再生能源生产的运行和效率。

# 中试沼气厂启动过程中微生物群落动态与功能预测研究解读

## 研究背景与意义

随着全球气候紧急状态的加剧，减少温室气体（GHG）排放已成为各国能源战略的核心议题之一。巴西作为农产品和动物源性产品的主要供应国，产生了大量农业废弃物和城市固体废弃物（MSW），其处置问题对健康和环境构成严峻挑战。与此同时，海关部门查获的有机货物也需要适当的环境管理以确保合规处置。在此背景下，利用厌氧消化（AD）技术将各类有机废弃物转化为沼气，不仅是实现废弃物资源化的有效途径，也是满足温室气体减排目标的重要替代方案。巴西目前已运行811座沼气厂，主要处理卫生废弃物（74%）、工业废弃物（16%）和农业废弃物（10%）。

厌氧消化是一个复杂的多步骤生化过程，依赖于水解、产酸、产乙酸和产甲烷四个阶段中多种厌氧微生物的协同作用。该过程的效率和稳定性高度取决于pH、温度、底物组成、营养物以及消化器结构和尺寸等参数，但最关键的因素是多样且稳定的微生物群落。任何操作扰动都可能改变微生物动态和相互作用，从而影响沼气产量和系统稳定性。厌氧消化管理面临的主要挑战之一是如何监测微生物丰富度和相互作用的变化。活性微生物可作为反应器运行性能的重要生物指示器，理解微生物群落动态对工艺优化至关重要。基于16S rRNA标记基因的宏条形码分析因其参考数据库的可获得性和成本效益而广泛应用，能够确定厌氧消化群落中的分类水平和潜在代谢活性。因此，本研究旨在利用宏条形码方法，在中试工厂反应器的三个不同时期——静止期（SP）、启动期（IP）和批量期（BP），比较微生物多样性和功能预测，使用的底物为城市固体废弃物和海关查获的各种有机物料。

## 研究技术与方法

研究人员开展这项研究使用了多种关键技术方法。首先，在巴西南部Foz do Igua?u/PR的Itaipu示范单元（DU）进行样本采集，该单元是一座处理Itaipu综合体内三家餐厅废弃物以及联邦税务局、联邦警察和农牧部（MAPA）查获废弃物的沼气生产工厂，反应器容积为450 m³，直径为10 m，高度为5 m，采用半连续进料方式，温度控制在37 °C。研究涵盖三个采样时间点：SP（2023年2月23日采集，间歇进料维持微生物种群）、IP（2023年3月27日采集，恢复进料）和BP（2023年6月12日采集，反应器以粉碎餐厅废弃物和海关查获货物进料）。理化参数分析依据标准方法（APHA et al. 2017）测定了总固体（TS）、固定固体（FS）、挥发性固体（VS）、pH、化学需氧量（COD）、铵、总磷和总氮；挥发性脂肪酸（VFA）采用高效液相色谱（HPLC）测定；FOS/TAC比值依据Nordmann方法测定。微生物群落分析方面，使用Soil DNA Isolation Kit提取总基因组DNA，采用Illumina MiSeq和HiSeq PE250平台进行二代测序，分别使用341F/806R引物（细菌V3-V4区）和519F/915R引物（古菌V4-V5区）扩增16S rRNA基因片段，测序数据经QIIME 2和DADA2算法进行质量控制、降噪和嵌合体去除后，与SILVA数据库（v.138）比对进行物种分类，并通过PICRUSt2软件结合KEGG Orthology（KO）数据库进行功能预测分析。

## 研究结果

### 理化参数分析

FOS/TAC比值是评估厌氧消化器负荷状态的重要指标，理想范围为0.3-0.4。研究结果显示，反应器在SP阶段处于欠负荷运行状态，FOS/TAC值为0.16；IP阶段随着进料恢复，该比值升至0.37，表明达到满负荷运行；而BP阶段反应器再次回落到欠负荷状态。这一模式表明反应器未在其最大沼气生产能力下运行，但这种欠负荷状态也意味着污泥未过载，保留了分解底物中有机物的能力。在VFA方面，SP阶段乙酸、丙酸和异丁酸浓度分别为621、147和5 mg/L。IP阶段酸含量远高于其他阶段，这归因于该时期反应器每日接收高浓度有机物，导致乙酸（5,049 mg/L）和丁酸（595 mg/L）浓度显著升高。COD参数方面，SP阶段COD值为42,250 mg O₂/L，表明存在大量未消耗的有机物；BP阶段COD降至13,539 mg O₂/L，反映出微生物活性的恢复和累积有机物的减少。铵浓度从SP到BP阶段呈上升趋势，BP阶段达到3,140 mg NH₄/L，这可能与该阶段进料中富含动物蛋白（如蛋类、红肉和奶类）有关。VS浓度在SP、IP和BP阶段分别为629.3、603.9和599.1 g/kg，IP阶段较高的VS浓度可能与反应器停机期间有机物的积累有关。

### 沼气和甲烷产量

沼气成分分析显示，IP阶段（约30天运行期）甲烷含量为68.3%；BP阶段沼气产量达到207 Nm³/天，甲烷含量为65.0%。甲烷含量的下降可能与不同底物的进料量增加有关，这可能改变了微生物代谢或产生了抑制甲烷生成的化合物。正常沼气中甲烷含量通常在50%-70%之间，高于65%表明沼气质量良好，具有高热值和能量价值。沼气中的H₂S虽然通常浓度较低，但对金属合金具有强腐蚀性，会降低热值并导致催化剂中毒，其燃烧还会释放二氧化硫等有害气体。IP阶段记录到H₂S峰值浓度为581 ppm，BP阶段为454.67 ppm。

### 微生物群落结构

细菌域方面，SP、IP和BP分别获得53,345、57,677和80,273条序列读数，经降噪后分别得到23,524、26,948和35,544条非嵌合序列。Shannon多样性指数显示细菌群落alpha多样性在SP和IP分别为4.29和4.56，表明进料启动阶段细菌多样性有所增加。在门水平上，IP、SP和BP分别鉴定出8、7和4个相对丰度≥1%的门。拟杆菌门（Bacteroidota）在SP占33.49%，并在其他采样点保持相对恒定（IP 32.65%，BP 34.90%），该门代表菌群已被证实可支持甲烷生成和产甲烷古菌的代谢，具有较快的倍增时间，负责复杂分子的水解，启动厌氧消化过程。厚壁菌门（Firmicutes）从SP的29.24%增加到IP的50.53%和BP的47.36%，该门与拟杆菌门的多种细菌物种均具有产酸代谢相关功能。热脱硫杆菌门（Caldatribacteriota）和互养菌门（Synergistota）在SP阶段共占细菌群落的10%，后者是短链脂肪酸产生菌，也是互养乙酸氧化细菌，与该系统中有机酸的完全消耗相一致。cloacimonadota门在所有阶段保持恒定（SP 7.73%、IP 6.27%、BP 8.55%），它们以丙酸氧化菌著称，对富含脂质的残留物具有重要作用。变形菌门（Proteobacteria）作为水解微生物，在SP阶段占5.06%。

在属水平上，SP、IP和BP样本中分别鉴定出124、138和103个细菌属。最优势的ASV为DMER64（属于Rikenellaceae科），SP占21.41%，BP占24.65%。该微生物类群为丁酸氧化菌，能将丁酸降解为乙酸和H₂，并可改善种间氢转移能力，维持厌氧消化在低氢分压下运行，从而促进氢营养型产甲烷作用。IP阶段观察到位点属Enterococcus（14.30%）显著增加和DMER64（11.15%）减少，肠球菌能分解顽固底物为乳酸和其他有机酸，并已被描述可与氢营养型产甲烷古菌形成互养关系。BP阶段互养单胞菌属（Syntrophomonas）增加，该属以脂肪酸氧化厌氧菌著称，与利用H₂的微生物以互养共生的方式生长。

古菌域方面，SP、IP和BP分别获得205,305、198,239和202,817条序列读数，经质控后分别得到101,263、136,608和141,103条序列。Shannon多样性指数在SP、IP和BP分别为2.38、1.41和0.20，呈现下降趋势，表明甲烷产量与特定古菌类群的选择有关。在门水平上，盐古菌门（Halobacterota）从SP的13.70%和IP的70.98%增加到BP的98.19%，该门包含以乙酸为电子供体的产甲烷物种，其主导地位表明系统中有机物的潜在去除能力可驱动沼气生成。广古菌门（Euryarchaeota）从SP的44.06%降至IP的15.18%和BP的1.10%。Micrarchaeota（25.32%）和热原体门（Thermoplasmatota）（16.25%）在SP阶段较高，随着厌氧消化进程逐渐下降至IP的5.75%和1.25%，BP阶段均低于1%。Micrarchaeota常见于酸性环境，代谢上依赖其宿主Thermoplasmatota，两者物理关联。Thermoplasmatota被归类为甲基营养型产甲烷菌，在猪粪接种物和消化物中曾被报道。

古菌属水平上，SP阶段优势属为Candidatus Methanofastidiosum（34.17%）、Micrarchaeales（21.31%）、RumEn_M2（14.87%）、甲烷螺菌属（Methanospirillum）（9.78%）、甲烷杆菌属（Methanobacterium）（9.14%）和甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）（3.37%），这些属在反应器适应和进料开始时减少。Candidatus Methanofastidiosum是具有氢营养代谢的产甲烷古菌；Methanospirillum和Methanobacterium是氢营养型产甲烷菌，利用甲酸盐、H₂和CO₂产生甲烷。IP阶段Methanosarcina占69.56%，BP阶段占97.96%，成为绝对优势属。Methanosarcina是代谢通才型产甲烷菌，可在H₂/CO₂、乙酸、甲醇和甲胺上生长。

### 代谢功能预测

基于PICRUSt2功能预测分析，从SP、IP和BP样本中共获得3,671个KO功能基因。在乙酸裂解代谢途径中，SP和IP样本中检测到较多与乙酸直接活化相关的关键基因——乙酰辅酶A合成酶（K01895），IP和BP样本中存在乙酰辅酶A脱羰基酶/合酶（K00193、K00194和K00197）。编码四氢甲烷蝶呤S-甲基转移酶（K00584）的基因在BP中占优势，该酶对将乙酸和CO₂转化为甲烷至关重要。与氢营养型产甲烷相关的酶如甲酰甲烷呋喃脱氢酶（K00201）、甲酸脱氢酶大亚基（K00123）、辅酶F420氢化酶β亚基（K00441）、甲酰甲烷呋喃脱氢酶（K00200、K00202、K00203）和丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶（K00169、K00170、K00171、K00172）在三个样本中均占优势，表明古菌使用的主要代谢途径为氢营养型途径，这与细菌属与氢营养型产甲烷古菌表现出互养代谢的现象相符。氢营养型代谢途径以H₂为电子供体还原CO₂，其关键酶包括4Fe-4S铁氧还蛋白（K00205）、次甲基四氢甲烷蝶呤环化水解酶（K01499）、亚甲基四氢甲烷蝶呤脱氢酶（K00319）、甲酰甲烷呋喃-四氢甲烷蝶呤N-甲酰转移酶（K00672）和5,10-亚甲基四氢甲烷蝶呤还原酶（K00320），这些酶与Methanosarcina的代谢相关。氢营养/乙酸裂解共同代谢途径的基因K00577、K00578、K00579、K00580、K00581、K00582和K00584在IP和BP中发现。SP和BP样本还检测到与甲基营养型产甲烷途径相关的酶，包括甲醇咕啉蛋白（K14081）、三甲胺-咕啉蛋白Co-甲基转移酶（K14083）、辅酶M甲基转移酶（K14080）等。甲基营养型途径是所分析代谢途径中基因频率最低的，这种功能冗余度的降低——即不同物种执行相似生态功能的情况——可能通过减少资源竞争和优化代谢效率来稳定复杂系统，从而促使厌氧消化系统趋向稳定。

## 讨论与结论

研究人员指出，理解厌氧消化的微生态系统对于确保从复杂废弃物（如Itaipu示范单元所用物料）中稳定生产优质沼气至关重要。水解微生物群落、发酵（产酸/产乙酸）细菌和产甲烷古菌之间的协同相互作用促成了有效的厌氧消化过程。宏分类学和功能代谢预测分析的结合对于理解厌氧系统十分重要，可作为一种常规策略应用于沼气工厂，有望提高甲烷的产量和质量。由于缺乏样本重复和统计数据，该研究以描述性方式讨论，微生物组数据基于相关性分析，不能建立因果关系，未来应开展利用宏转录组学的验证研究以更好地理解功能概况。

本研究调查了中试规模反应器处理城市固体废弃物和海关查获有机底物过程中，覆盖静止（非运行）、启动和运行阶段的微生物群落和预测功能代谢。BP阶段沼气产量达到207 Nm³/天，甲烷浓度为65%。与水解和产酸相关的门类如拟杆菌门保持恒定，厚壁菌门在沼气生产阶段占优势。DMER64属为主导菌属，同时氢营养型类群从静止期的Candidatus Methanofastidiosum过渡到沼气生产阶段的Methanosarcina完全优势。关键的氢营养代谢和CO₂还原为CH₄相关酶被成功推断。利用宏分类学监测厌氧消化中的微生物群落是阐明群落内变化的有效工具，也是优化沼气生产的宝贵资源。未来研究应使用更短时间间隔采集的重复样本，以提高对沼气生产和微生物群落演替的解析精度。