综述：肿瘤抑制基因缺失的基因医学策略：基于自扩增RNA的治疗性替代

《Pharmaceutical Research》：Genetic Medicine Approaches for Tumor Suppressor Loss: Therapeutic Replacement with Self-Amplifying RNA

　　

摘要：肿瘤抑制基因的缺失或功能性失活是人类癌症的一个标志性特征。与过度活化的癌基因不同——后者产生的蛋白质可通过药理学抑制进行靶向——鉴于肿瘤抑制基因的功能丧失特性，恢复肿瘤抑制蛋白活性的治疗策略面临挑战。目前基于替代的策略，利用病毒载体和非扩增RNA疗法重建肿瘤抑制基因功能，存在诸多困难，包括所恢复的肿瘤抑制蛋白表达短暂和/或不充分。在本综述中，研究人员强调自扩增RNA（saRNA）作为下一代肿瘤抑制基因恢复平台。saRNA能够在较低剂量下实现细胞内RNA扩增和延长蛋白表达，同时避免基因组整合，从而可能克服现有替代方法的关键局限。此外，通过整合基因组复发频率、递送可行性、构建体限制和通路生物学，研究人员描述了一个转化优先排序框架，以识别最适合基于saRNA替代的肿瘤抑制基因，特别强调携带复发性纯合性缺失的癌症。利用saRNA有效恢复肿瘤抑制蛋白活性将为癌症治疗开辟新途径。

引言：肿瘤抑制基因在细胞增殖、存活、分化和基因组稳定性中发挥关键调控作用。与通过功能获得性激活促进肿瘤发生的癌基因不同，肿瘤抑制基因主要通过功能丧失性改变导致癌症发展，从而禁用保护性细胞程序。肿瘤抑制基因调控多种生物学过程，包括细胞周期进程、DNA损伤修复、凋亡、染色质重塑和代谢稳态。肿瘤抑制基因功能丧失是人类癌症的标志性分子事件，通过突变、表观遗传沉默、杂合性缺失、纯合性（深度）缺失、整条染色体丢失和病毒灭活等机制产生。大规模癌症基因组学研究（包括癌症基因组图谱TCGA和纪念斯隆凯特琳癌症中心可操作癌症靶点整合突变谱MSK-IMPACT）揭示了多种恶性肿瘤中主要肿瘤抑制基因的复发性纯合性缺失，如胶质母细胞瘤、肉瘤、间皮瘤、前列腺癌和胰腺癌。在这些机制中，纯合性缺失尤为突出，因为它完全消除了蛋白质表达和活性。因此，肿瘤抑制基因纯合性缺失常常驱动侵袭性疾病、基因组不稳定、治疗耐药和多种肿瘤类型的不良临床结局。与可通过药理学抑制的癌基因不同，肿瘤抑制基因常常缺失或失去功能，且往往缺乏可成药的酶结构域。因此，尽管其在癌症发展中作用突出，其生物学特性仍构成重大治疗挑战。这些挑战推动了基于基因替代的治疗方法的兴趣增长，以重新建立癌细胞中的肿瘤抑制基因活性。在TP53被鉴定为通用肿瘤抑制基因后，早期基因替代工作使用腺病毒载体将野生型TP53重新导入恶性细胞。如今，肿瘤抑制基因替代策略采用多种递送平台，包括腺病毒载体、腺相关病毒（AAV）系统、溶瘤病毒、质粒/纳米颗粒方法和mRNA疗法。经典复制缺陷型腺病毒载体以非整合附加体DNA形式递送转基因。这种方法具有高转导效率、大包装容量和强转基因表达等优势。此外，腺病毒递送诱导的促炎微环境可能通过将免疫惰性（“冷”）肿瘤转化为免疫刺激性（“热”）微环境来提供额外治疗益处，从而支持抗肿瘤免疫反应。然而，若干限制阻碍了腺病毒递送系统的使用。最显著的是，腺病毒转基因的附加体性质促进细胞分裂期间的稀释，需要频繁重新给药，并在快速增殖肿瘤中造成特别风险。其他限制包括有限的肿瘤特异性靶向、临床安全问题和炎症毒性，这些都持续限制其更广泛的临床实用性。重组腺相关病毒（AAV）载体的开发解决了经典腺病毒递送的一些限制。AAV系统提供良好的安全性特征，具有较低致病性和降低的免疫刺激活性，同时在有丝分裂后非分裂细胞群体中支持长期转基因表达。然而，在肿瘤应用中，AAV载体面临实现充分和持续重新给药的相同基本挑战。这一限制，加上其受限的转基因包装容量，削弱了AAV和腺病毒平台用于长期肿瘤抑制基因替代的转化可行性。溶瘤病毒平台代表一种机制上不同的方法，依赖复制感受态载体（如单纯疱疹病毒或新城疫病毒），而非传统腺病毒或AAV基因疗法中使用的复制缺陷型载体。研究人员工程化这些病毒载体以通过识别过表达的表面受体优先靶向肿瘤细胞。瘤内病毒复制驱动恶性细胞的直接细胞溶解破坏，同时激活先天性和适应性抗肿瘤免疫反应。将肿瘤抑制基因转基因整合到溶瘤病毒骨架中创造了双重治疗机制，结合受体靶向细胞溶解与转基因介导的抗增殖信号替代。关键的是，持续的病毒复制提供了转基因表达的自我更新来源，避免了影响复制缺陷型载体的附加体稀释，从而为表达持久性问题提供了潜在解决方案。然而，溶瘤平台仍受限于系统性递送不足、肿瘤细胞亚群对生产性病毒感染的异质性易感性，以及维持可接受治疗安全边际所需的严格减毒。除病毒基因递送机制外，非病毒质粒纳米颗粒系统为肿瘤抑制基因替代提供了替代策略。这些平台提供两个主要优势：显著更大的转基因包装容量和通过纳米颗粒表面修饰实现肿瘤特异性递送的能力。然而，基于质粒的方法面临相同的基本限制，即瞬时表达。与病毒递送平台相比，其体内转染效率相对较差，进一步限制了其用于持续肿瘤抑制基因替代的实用性。最近开发的合成mRNA疗法，通常配制成脂质纳米颗粒（LNP）递送系统，可容纳更大的转基因，同时避免基因组整合并保持良好的安全性特征。重要的是，mRNA疗法比病毒载体重新给药策略更支持重复临床给药，这一特性推动了其应用于肿瘤抑制基因替代的兴趣。尽管有这些优势，快速细胞内mRNA周转从根本上限制了蛋白质表达的持续时间，并限制了mRNA疗法在需要持续肿瘤抑制基因活性场景中的实用性。此外，mRNA构建体对货物容量施加限制，并使从单个转录本递送两种、三种或更多蛋白质复杂化。最后，研究人员在向体内肿瘤细胞递送治疗性mRNA载荷时仍面临重大挑战。免疫抑制和物理限制的肿瘤微环境，加上肿瘤细胞特异性LNP摄取不足，持续限制递送效率。自扩增RNA（saRNA）代表一种先进的下一代RNA治疗平台，解决了上述病毒和非病毒基因递送系统的若干限制（表1总结）。saRNA衍生自甲病毒复制子系统，如辛德比斯病毒和委内瑞拉马脑炎病毒，编码治疗目的基因（如肿瘤抑制基因）和病毒复制酶复合物（nsP1–4）。该复制酶编码RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP），驱动细胞内RNA扩增。典型的saRNA构建体包含5′帽、3′poly(A)尾、复制酶编码区、亚基因组启动子和下游治疗转基因（图1）。在细胞质递送后（通常通过LNP系统），复制酶生成负链中间体，产生多个正链RNA拷贝，从而能够从相对较低的初始RNA剂量实现延长和放大的蛋白质表达。最近saRNA COVID-19疫苗在日本和欧洲的监管批准进一步凸显了这一新兴治疗类别的转化潜力。在临床研究中，saRNA作为COVID-19疫苗加强针诱导优越且更持久的免疫反应，同时需要的剂量比传统mRNA平台低六倍。作为RNA递送系统、合成生物学和构建体工程技术持续成熟，肿瘤抑制基因替代越来越表现为可行的治疗策略，而非纯粹概念性方法。然而，成功的基因替代疗法高度依赖于肿瘤抑制基因生物学、递送效率和受影响通路的信号传导背景。在本综述中，研究人员检验saRNA作为基因替代的新兴平台，提出系统优先排序肿瘤抑制基因靶点的框架，并应用该框架评估肿瘤抑制基因替代策略的转化可行性。首先概述选择saRNA作为递送平台的理由。然后介绍肿瘤抑制基因优先排序框架，并评估先前探索的基因替代策略和选定肿瘤抑制基因的关键生物学考虑。最后以对该新兴治疗方式的总结和展望结束。

saRNA作为肿瘤抑制基因替代平台：如上所述，自扩增RNA（saRNA）代表一种有前景的治疗方式，用于恢复癌症中的肿瘤抑制基因功能，特别是以纯合性缺失为特征的癌症。早期肿瘤抑制基因替代工作中遇到的限制凸显了能够实现强大细胞内蛋白质生产的递送平台的重要性。saRNA的一个主要优势在于其扩增细胞内RNA的能力。一旦递送，saRNA通过复制酶介导的自扩增从单个分子生成多个RNA拷贝，即使在递送效率有限的情况下也能产生高水平的蛋白质表达。这一特性在肿瘤中尤为重要，因为异质性血管化、升高的间质压力和低效的纳米颗粒渗透通常限制治疗性RNA仅递送至实体瘤内的一部分肿瘤细胞。因此，放大的细胞内表达可能部分补偿低效的肿瘤递送，这是限制早期腺病毒和质粒肿瘤抑制基因疗法的主要局限。此外，与传统mRNA相比，saRNA表现出剂量节省特性。临床前研究表明，saRNA在显著较低剂量下实现相当或更高的蛋白质表达。掺入修饰核苷酸进一步增强这一优势，能够在降低剂量下实现数周的延长表达，同时最小化免疫介导的抑制。这些特性特别有利于需要持续细胞内丰度以激活下游信号通路的肿瘤抑制基因。例如，TP53替代疗法需要重复腺病毒给药，因为瞬时p53蛋白表达迅速减弱下游信号活性。saRNA的另一个优势是完全在细胞质中运作，不整合到宿主基因组中，从而最小化与病毒载体相关的插入突变风险。它还避免了腺相关病毒（AAV）的严格包装限制，能够递送更大的肿瘤抑制基因并掺入更复杂的遗传载荷。虽然非常大的转录本仍可能损害复制效率和纳米颗粒封装，但saRNA系统比传统病毒载体允许显著更大的工程灵活性。此外，saRNA递送的优势在于其能够在单个构建体内编码多个目的基因；例如，通过使用多个亚基因组启动子或多顺反子设计。这一能力对于涉及多个蛋白质协同活性的肿瘤抑制通路尤其相关。在纯合性缺失背景下，此类设计能够同时替代互补通路组件，可能改善功能拯救。重要的是，saRNA介导的基因替代的适用性在本综述分析的肿瘤抑制基因中差异显著，并强烈依赖于受影响通路的生物学架构。通过相对线性和明确信号轴发挥作用的肿瘤抑制基因代表特别有利的基因替代候选。相反，嵌入高度背景依赖性信号网络或广泛表观遗传调控程序的肿瘤抑制基因可能被证明更难恢复。CDKN2A位点引入了额外的复杂性，因为它编码两个不同的蛋白质产物，p16^INK4a和p14^ARF。有效的基因替代可能因此需要两个蛋白质的协调表达。成功的拯救因此依赖于能够同时替代多个功能性基因产物的先进构建体设计。肿瘤抑制基因缺失的基因组背景关键影响基因替代策略的可行性。基于saRNA的基因替代与携带纯合性缺失的肿瘤特别兼容，因为内源蛋白质的完全缺失消除了显性负干扰，并创造了遗传学上干净的功能丧失状态。相反，表达显性负性或功能获得性突变蛋白的肿瘤即使在发生外源蛋白表达时也可能对基因替代保持抵抗。这一挑战在TP53突变癌症中经常出现，其中突变p53蛋白与野生型p53寡聚化并抑制其活性。因此，TP53基因替代在携带纯合性TP53缺失的肿瘤中可能产生不同于由错义突变驱动的肿瘤的治疗结果。靶向表达功能获得性突变肿瘤抑制基因的癌症的替代方法可以是递送含有常见突变序列的saRNA，例如患者中发现的热点p53突变体，以癌症疫苗的形式。saRNA作为疫苗的临床使用可因此被采用以启动T细胞识别这些突变基因作为癌症新抗原，这种方法已通过mRNA递送在实体瘤中显示出前景。saRNA的另一个重要优势是其通过多顺反子构建体或掺入多个亚基因组启动子支持多基因表达的能力。此类设计促进多个功能性基因产物的协调基因替代，如CDKN2A等靶点可能需要的。除了单纯的基因替代，未来的方法理论上可以将肿瘤抑制基因替代与免疫调节或促凋亡效应器结合，以增强抗肿瘤疗效并克服限制早期基因替代策略的耐药机制。此外，saRNA自然补充针对携带纯合性缺失的肿瘤的基因替代策略。在这些情况下，内源基因的完全缺失阻止基于转录激活或修复的方法恢复基因功能。相反，治疗功效取决于外源编码序列的递送和实现足够的蛋白质表达，而saRNA介导的扩增直接解决这些要求。总的来说，这些观察表明，成功的肿瘤抑制基因替代需要仔细匹配肿瘤抑制基因生物学与递送平台架构。saRNA似乎特别适合具有纯合性缺失、有限显性负干扰和相对可解释的下游信号输出的紧凑型肿瘤抑制基因。然而，恢复高度背景依赖性或网络级调节因子可能需要显著更复杂的工程策略和组合治疗方法。尽管有其优势，saRNA在有效恢复肿瘤抑制基因功能之前必须解决若干限制。递送效率仍然是一个主要挑战，特别是在实体瘤中，异质性纳米颗粒摄取通常限制肿瘤覆盖。即使saRNA实现强大的细胞内扩增，不完全的肿瘤覆盖也可能降低治疗功效。先天免疫激活是另一个障碍，因为细胞质传感器如RIG-I和MDA5识别saRNA复制过程中产生的双链RNA中间体，触发I型干扰素反应，抑制翻译并促进RNA降解。历史上，这些反应通过降低复制效率和蛋白质表达限制了saRNA性能。然而，最近证据表明核苷酸工程减轻了这一限制。用修饰核苷酸完全替代抑制干扰素信号传导，同时保留复制能力，从而在多种细胞类型中实现强大且持续的蛋白质表达。这些发现表明免疫激活代表可调属性而非平台的固有局限。saRNA构建体相对较大的尺寸也影响复制效率和递送性能，特别是当额外遗传元件增加构建体复杂性时。同样，复制酶活性可能施加细胞应激并改变宿主基因表达，尽管研究人员继续调查这些效应影响治疗性能的程度。另一个限制是表达的瞬时性。虽然saRNA相对于非复制mRNA延长了蛋白质生产的持续时间，但表达通常仅持续数周，可能需要重复给药以维持治疗活性。虽然基于LNP的递送系统通常提供比病毒载体更好的安全性和更大的重复给药潜力，但颗粒特异性免疫原性可能限制重复给药。特别是，PEG化LNP制剂可能引发抗聚乙二醇（PEG）抗体，加速纳米颗粒清除并可能降低后续给药的功效。因此，研究人员继续通过开发替代隐身聚合物来优化LNP组成，以减少免疫识别，以及其他旨在实现重复给药的制剂策略。同时，表征saRNA表达动力学和工程化可调复制系统的持续努力将为表达幅度和持续时间提供更精确的控制，允许研究人员根据特定肿瘤抑制靶点的生物学要求定制表达谱。虽然saRNA通过连续RNA复制产生高水平的蛋白质表达，但这种延长的扩增可能并非对所有治疗应用都是理想的。精确的时间控制或停止表达的能力对于改善安全性和有效性至关重要。令人兴奋的是，这一限制最近已通过开发诱导型saRNA平台得到解决。在该系统中，工程化RdRp和目的蛋白包含不稳定结构域，在缺乏小分子甲氧苄啶时触发其降解，从而阻止RNA扩增。该策略实现saRNA活性的可逆、剂量依赖性控制，有效提供明确的开关，同时保留常规saRNA的高蛋白表达特征。然而，该方法需要连续施用高剂量甲氧苄啶以维持saRNA功能。除了上述生物学限制，化学、制造和控制（CMC）考虑因素仍然是saRNA疗法临床转化的重大挑战。化学上，saRNA分子同时编码治疗转基因和病毒复制酶，使其显著大于传统mRNA。这种增加的尺寸使RNA合成和纯化复杂化，并导致更复杂的二级结构。此外，较大的RNA分子在生产过程中更容易断裂或降解，使得在整个制造过程中保持全长RNA更加困难。严格的纯化策略还必须去除双链RNA污染物、残留DNA模板、酶和截短RNA种类，以最小化先天免疫激活并确保产品质量。制造也带来巨大挑战，因为saRNA分子的大尺寸增加了制剂、大规模生产和有效LNP封装的复杂性。制造商必须在工艺放大过程中一致地生产具有可重复特征的saRNA-LNP制剂，以支持临床开发。尽管与大型saRNA构建体相关的增加制造复杂性可能增加生产成本并限制工艺可扩展性，但saRNA的剂量节省特性将在某些治疗场景中部分抵消这些挑战。最后，严格的质量控制，包括在制造和储存过程中仔细监测封装效率、粒径、聚集、效力和储存稳定性，对于临床转化仍然至关重要。可扩展RNA合成、纯化技术、制剂化学和分析表征的持续进步将促进临床转化，并帮助推动基于saRNA的肿瘤抑制基因替代从实验系统走向患者护理。最后，仅恢复蛋白质表达可能无法完全克服下游通路重塑、凋亡抵抗、免疫逃逸或在肿瘤进化过程中出现的补偿性致癌信号。因此，成功的肿瘤抑制基因替代不仅取决于恢复缺失蛋白质，还取决于有效重新建立下游生物学功能。这些观察表明，基于saRNA的基因替代策略将需要递送工程的持续进步以及涉及化疗、靶向治疗、放疗或免疫治疗的合理组合方法。

肿瘤抑制基因替代靶点的优先排序：基因医学（包括病毒基因疗法、mRNA疗法和基因编辑技术）的快速成熟重新激发了对治疗性肿瘤抑制基因替代的兴趣。历史上，研究人员认为肿瘤抑制基因“不可成药”，因为肿瘤药物开发主要集中在抑制功能获得性癌基因而非恢复丢失的基因活性。然而，核酸递送系统和合成生物学的进展现在支持重新考虑肿瘤抑制基因替代作为可行治疗模式。为识别具有最高转化潜力的肿瘤抑制基因用于基因医学方法，研究人员开发了一个整合基因组复发频率、治疗可操作性、递送可行性和生物学安全性的优先排序框架（图2）。最初候选基因来源于COSMIC癌症基因普查，这是通过癌症体细胞突变目录（COSMIC）维护的专家策划癌症驱动基因目录。具体来说，选择COSMIC大片段缺失数据集（>1千碱基（kb）缺失）中代表的基因，因为复发性缺失事件构成肿瘤抑制基因失活的常见机制，并提供系统识别跨不同癌症类型处于丢失选择压力下基因的手段。尽管大片段缺失不一定对应于纯合性缺失，但复发性缺失事件为识别值得进一步评估作为基因替代治疗靶点的肿瘤抑制基因提供了有效起点。使用cBioPortal癌症基因组学平台评估基因组复发频率和肿瘤亚型特异性，该平台聚合大规模多维癌症基因组学数据集，支持体细胞突变和拷贝数改变的综合分析。研究了两个主要队列：TCGA PanCancer队列和MSK-IMPACT临床测序队列（约50,000个肿瘤）。这些数据集允许评估跨肿瘤类型纯合性缺失的普遍性。随后根据四个主要标准优先排序通过该工作流程识别的候选基因：首先，候选基因必须在定义的癌症亚型中至少五名患者中显示复发性纯合性缺失。优先排序纯合性缺失，因为它们造成完全功能基因丧失，并减少与错义突变、部分功能丧失等位基因或表观遗传沉默相关的模糊性。从治疗角度看，纯合性缺失为基因替代策略提供了最清晰的理由。尽管某些缺失事件发生在个体肿瘤类型的相对较小分子亚群中，但即使低频改变也影响大量癌症患者，并且常常表征临床需求显著未满足的癌症。重要的是，精准肿瘤学越来越针对生物学定义的患者亚群而非仅仅高流行改变，使得复发但较不常见的基因组事件可能成为有意义的治疗靶点。其次，根据蛋白质编码序列大小过滤基因，并选择约100碱基对（bp）至6kb的包含范围。该标准反映了当代基因医学平台（包括AAV载体、LNP介导的RNA递送系统和saRNA疗法）相关的工程和递送限制。较大的编码序列通常更难制造、包装和有效递送，并且常常在多种递送方式中表现出降低的性能。这些挑战与saRNA系统特别相关，其中治疗转基因必须与RNA扩增所需的大约7kb复制酶盒一起容纳。总的来说，这些考虑促使优先排序编码序列在当前和新兴基因医学平台治疗可操作范围内的肿瘤抑制基因。第三，评估基因的现有治疗先例。优先排序先前已在临床或临床前探索过恢复策略的肿瘤抑制基因，包括病毒基因替代、mRNA疗法、CRISPR介导的纠正或药理学通路补偿。先前的治疗努力提供了机制合理性的证据，并部分降低了后续转化开发的风险。第四，将生物学安全考虑纳入靶点选择。评估候选基因的潜在毒性，包括超生理表达、组织特异性功能限制和通路冗余。这些考虑在基因医学中尤为重要，因为持久表达或广泛系统性递送可能在正常组织中产生意外毒性。应用该框架将初始通过基因组筛选识别的45个缺失相关肿瘤抑制基因减少到12个高优先候选基因。重要的是，该框架强调肿瘤抑制基因的转化优先排序需要将癌症基因组学与递送工程、治疗方式选择和系统级生物学相结合。随着基因医学平台持续成熟，特别是在靶向递送和可编程基因调控领域，此类优先排序框架有助于识别最适合临床意义治疗性基因替代的肿瘤抑制基因改变子集。为进一步评估复发性肿瘤抑制基因缺失的临床相关性，在TCGA和MSK-IMPACT队列中进行了生存和流行率分析。虽然肿瘤抑制基因改变广泛地与不良临床结局相关，但纯合性缺失代表特别严重的失活形式，因为它们完全消除基因功能。跨数据集，在一种或多种优先肿瘤抑制基因中携带纯合性缺失的患者表现出显著更差的总生存期，相对于缺乏这些改变的患者（图3A-B）。基因特异性风险比分析进一步支持纯合性缺失事件与不良临床结局之间的关联（图3C），而肿瘤亚型分析识别了这些改变以临床有意义频率发生的不同癌症背景（图3D-E）。总的来说，这些发现表明纯合性肿瘤抑制基因缺失不仅在生物学上具有后果，而且定义了具有特别侵袭性疾病的患者亚群。复发性缺失频率、不良生存关联和可识别肿瘤特异性富集的趋同加强了将这些改变优先排序为基于基因替代的基因医学策略靶点的理由。

选定靶点的现有肿瘤抑制基因替代疗法：根据文献中先前肿瘤抑制基因替代策略的证据，将框架产生的12个高优先肿瘤抑制候选基因分为三类：临床探索靶点、临床前探索靶点和未探索靶点。表2总结了12个分类的肿瘤抑制候选基因及其相关基因替代策略。第一类包括临床探索的肿瘤抑制基因替代靶点，仅由TP53代表，多种基因治疗方法已进入临床评估。这些项目为基于基因替代的肿瘤治疗学提供了重要的概念验证证据。第二类包括具有大量临床前基因替代努力的肿瘤抑制基因，包括PTEN、VHL、RB1、SMAD4、SMARCB1和CDKN2A。这些基因代表特别有吸引力的候选，因为它们结合了复发性基因组丢失与生物学上可解释的信号传导后果以及日益增加的递送可行性。第三类包括尚未进行直接基因替代研究的肿瘤抑制基因。相反，先前研究集中于间接靶向或合成致死方法而非直接替代，包括LATS2、AMER1、STK11、MAP2K4和BIRC3。在这些背景下，药理学利用通路失调产生的脆弱性可能比直接替代缺失基因更可行。

临床探索的肿瘤抑制基因替代靶点：TP53。TP53编码转录因子p53，细胞应激反应的中心调节因子，整合来自DNA损伤、癌基因激活、缺氧和代谢扰动的信号。激活后，p53协调广泛的转录程序，通过下游靶点如p21、BAX和GADD45促进细胞周期停滞、凋亡、衰老、DNA修复和代谢适应。通过这些协调功能，p53作为主肿瘤抑制基因，保持基因组稳定性并防止受损或转化细胞的扩增。TP53功能丧失发生在广泛的恶性肿瘤中，代表人类癌症中最频繁的改变之一。虽然肿瘤常获得显性负性TP53突变，但特定癌症亚型，包括肉瘤和某些血液恶性肿瘤，也携带纯合性TP53缺失。p53功能丧失伴随基因组不稳定、治疗耐药和不良临床结局。重要的是，完全TP53丧失的肿瘤缺乏残余p53活性，使其在概念上适合基因替代策略。由于p53发挥关键肿瘤抑制作用，研究人员投入大量努力将TP53替代疗法转化到临床。三种复制缺陷型重组TP53腺病毒疗法（Gendicine、Advexin和SCH-58500）已进入临床评估。2003年，Gendicine（深圳赛百诺基因技术）成为全球首个获批的基因疗法，中国监管机构批准其用于头颈部鳞状细胞癌。此后，研究人员在多种癌症类型中评估了Gendicine与化疗和放疗的组合，包括非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、肝细胞癌和卵巢癌。这种对联合治疗的重视反映了放疗和化疗诱导的DNA损伤通常依赖p53依赖性信号传导以驱动癌细胞走向凋亡或细胞周期停滞。腺病毒TP53递送功能性恢复p53信号传导，使化疗和放疗诱导的DNA损伤能够更有效地消除或停滞癌细胞。Gendicine的临床试验显示良好的安全性特征，并表明TP53替代与化疗或放疗联合比单独常规治疗产生显著更高的反应率。类似的TP53腺病毒基因疗法Advexin（Introgen Therapeutics）在1990年代末和2000年代初进入美国超过30项临床试验。然而，2008年结束的关键III期临床试验显示有限疗效，阻止了在美国的FDA批准。SCH-58500（先灵葆雅）同样在I/II期临床测试中显示不一致的疗效，并未提供优于标准疗法的优势。这些结果可能反映了美国强调开发TP53腺病毒疗法作为独立单药疗法，而中国的临床试验将Gendicine与化疗和放疗联合以最大化疗效。递送效率低下、次优剂量和下游通路缺陷进一步限制了美国临床试验的疗效，导致当研究人员将这些疗法作为单药施用时抗肿瘤反应不一致。此外，所有TP53腺病毒给药方案需要每72小时重复施用以维持足够的p53表达和下游信号活性。除了腺病毒基因疗法，研究人员推进了基于质粒的疗法进入临床评估。SGT-53（SynerGene Therapeutics）由编码TP53的质粒封装在脂质体中，脂质体装饰有抗转铁蛋白受体scFv以促进选择性肿瘤细胞靶向。然而，与早期腺病毒方法类似，SGT-53在I期临床试验中作为独立治疗时未提供显著优于常规疗法的获益。不一致的递送、瞬时表达和内在凋亡抵抗限制了其疗效。因此，研究人员在II期临床试验中将SGT-53与化疗联合，以恢复野生型p53活性并使肿瘤细胞对化疗诱导的细胞毒性敏感。如今，对将TP53基因疗法与免疫疗法结合的联合策略重新产生兴趣。这些方法旨在将肿瘤转变为更具免疫原性和免疫可见的状态，从而增强免疫疗法的功效。MultiVir进行的II期研究评估了TP53腺病毒疗法与免疫检查点抑制剂联合的安全性和有效性，发现联合疗法比任一单药疗法具有显著更大的肿瘤缩小。研究人员最初提出将SGT-53与化疗和检查点抑制剂联合的I期研究，但后来撤回了该试验。TP53 mRNA疗法也正在临床前评估中，既作为单药也作为联合策略。在体内癌症模型中递送TP53 mRNA产生抗肿瘤效应并增加肿瘤对mTOR抑制剂的敏感性。此外，TP53 mRNA逆转免疫抑制并与免疫检查点抑制剂联合增强抗肿瘤功效。然而，与构建体稳定性、递送效率和蛋白质表达持续时间有限相关的挑战继续限制这种方法。野生型TP53表达的替代也可以增强需要功能性p53信号传导的治疗策略，包括MDM2和MDMX抑制剂。这些药剂阻断MDM2介导的p53降解，从而增加p53丰度和转录活性。然而，它们在携带TP53缺失或突变的癌症中提供有限获益，突出需要首先恢复野生型p53活性，从而将这些新兴疗法的实用性扩展到更广泛的肿瘤背景。

临床前探索的肿瘤抑制基因替代靶点：PTEN。PTEN编码磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN），一种脂质磷酸酶，通过去磷酸化磷脂酰肌醇（3,4,5）-三磷酸（PIP3）负调控PI3K/AKT/mTOR信号通路。通过该功能，PTEN作为细胞生长、增殖和存活信号的关键刹车。PTEN缺失导致AKT信号组成性激活，从而促进肿瘤发生和凋亡抵抗。PTEN缺失在多种癌症类型中频繁发生，包括胶质母细胞瘤、前列腺癌、子宫内膜癌和黑色素瘤，通常通过纯合性缺失或杂合性缺失。PTEN缺陷肿瘤经常表现出侵袭性临床行为和对靶向疗法的抵抗，包括PI3K抑制剂，因为通路重塑和反馈机制减弱治疗反应。PTEN编码序列相对紧凑及其明确的生化功能使其成为基因替代方法的有吸引力的候选。尽管尚无PTEN替代疗法进入临床，研究人员继续在临床前模型中开发评估腺病毒、AAV和mRNA方法。多个小组已评估PTEN腺病毒递送在多种癌症类型中的肿瘤抑制效果，包括结直肠癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、子宫内膜癌和前列腺癌。总的来说，PTEN腺病毒转导产生强效肿瘤生长抑制，尽管有限的转导效率和瞬时表达阻碍了临床转化。PTEN AAV疗法的临床前研究同样显示实质性肿瘤抑制，但不足的载体分布常常导致不完全肿瘤覆盖和残留肿瘤细胞持续存在。最近，研究人员探索了携带PTEN的单纯疱疹病毒和新城疫病毒来源的溶瘤平台，以结合PTEN替代的肿瘤抑制效应与溶瘤病毒的肿瘤选择性细胞溶解活性。PTEN mRNA疗法获得越来越多的关注，因为mRNA递送系统通常实现比病毒载体更大的肿瘤穿透。多个小组报告了PTEN mRNA构建体的抗肿瘤功效。随着支持PTEN mRNA疗法抗肿瘤活性的证据积累，该领域日益转向联合策略和通过载体工程优化肿瘤递送。尽管PTEN mRNA疗法显示出抑制肿瘤生长的前景，但由于mRNA表达的瞬时性，它们仍需要重复给药。低效的生物分布仍然是一个主要挑战，持续努力继续集中在改善递送效率。

VHL。VHL编码冯·希佩尔-林道（VHL）蛋白，作为E3泛素连接酶复合体的部分，在常氧条件下靶向缺氧诱导因子（HIF）转录因子进行降解。VHL丧失稳定HIF1α和HIF2α，导致参与血管生成、代谢和细胞存活的基因转录激活，包括VEGF和GLUT1。VHL丧失代表透明细胞肾细胞癌（ccRCC）的定义性特征，其中肿瘤频繁获得VHL突变或缺失。靶向VHL丧失下游后果的治疗策略，如HIF2α抑制剂（例如belzutifan），显示出临床疗效。然而，这些方法仅解决VHL丧失的更广泛转录后果的一部分。原则上，替代VHL功能可以提供通路活性的更全面正常化。VHL替代疗法在很大程度上仍未探索，因为大多数努力集中于抑制HIF2α而非补充VHL本身。几个小组已评估脂质体和纳米颗粒方法，递送编码功能性VHL拷贝的质粒。递送到细胞或小鼠模型后，VHL表达适度降低癌细胞增殖和肿瘤生长，尽管递送不足限制最大疗效。最近，研究人员使用腺病毒VHL基因疗法评估VHL替代在骨肉瘤中的治疗潜力，并在体外和体内证明抑制骨肉瘤生长。正如观察到的其他腺病毒基因替代策略，持久和强效VHL表达可能需要重复腺病毒施用以实现最大肿瘤生长抑制。

RB1。RB1编码视网膜母细胞瘤蛋白（pRb），G1/S细胞周期转换的关键调节因子。pRb通过结合和抑制E2F转录因子控制细胞周期进程，从而阻止DNA合成所需基因的转录。pRb被CDK4/6磷酸化释放E2F并允许细胞周期进展。RB1丧失发生在多种癌症中，包括视网膜母细胞瘤、小细胞肺癌和骨肉瘤，通常通过纯合性缺失或失活突变。RB1丧失导致组成性E2F激活和不受控制的增殖。重要的是，RB1状态是CDK4/6抑制剂反应的关键决定因素，因为这些药剂需要功能性pRb发挥其作用。pRb缺陷肿瘤因此代表治疗空白，其中间接通路抑制提供有限获益，突出直接基因替代策略的潜在价值。当前针对RB1缺陷癌症的治疗策略主要利用RB1丧失导致的细胞周期失调而非替代功能性RB1表达。早期研究通过开发用于治疗应用的腺病毒RB1基因疗法确立了RB1替代的可行性。随后，研究人员开发了基于AAV的RB1基因疗法用于视网膜母细胞瘤的临床前评估，并在患者来源异种移植（PDX）模型中证明适度肿瘤减少。然而，这些疗法并未优于视网膜母细胞瘤的一线化疗，表明RB1替代的最大治疗价值可能在于使肿瘤对依赖功能性pRb活性的药剂敏感，包括CDK4/6抑制剂。

SMAD4。SMAD4编码SMAD家族成员4（SMAD4），转化生长因子-β（TGF-β）信号通路的核心介质。TGF-β受体激活后，受体调节的SMAD（SMAD2/3）与SMAD4形成复合物并转位到细胞核，调节参与细胞周期停滞、分化和凋亡的基因转录。SMAD4在胰腺导管腺癌、结直肠癌和胃癌中频繁失活，通常通过纯合性缺失。SMAD4丧失破坏经典TGF-β信号传导并促进肿瘤进展、侵袭和转移。值得注意的是，TGF-β信号传导表现出背景依赖性作用，在早期疾病阶段作为肿瘤抑制因子，在后期阶段作为促转移因子，从而使治疗靶向复杂化。缺乏针对SMAD4丧失的直接治疗策略凸显了基于替代方法的潜在机会。存在多种方式的几种SMAD4替代疗法，包括腺病毒、溶瘤病毒和mRNA方法。多个小组使用编码SMAD4的腺病毒载体评估胰腺癌、乳腺癌和脑癌模型中的抗肿瘤活性。其他研究人员开发了携带SMAD4的溶瘤腺病毒，以结合SMAD4替代的肿瘤抑制效应与溶瘤病毒的肿瘤选择性细胞溶解活性。此外，研究人员生成了封装在RNA折纸递送载体中的SMAD4 mRNA疗法，并在结直肠癌模型中证明肿瘤生长抑制。在这些研究中，SMAD4替代在体外和体内显著抑制癌细胞增殖和肿瘤生长。然而，尽管其强有力的生物学理由，SMAD4替代仍处于临床前阶段，因为低效递送、瞬时表达和现有递送平台的复杂安全性特征继续限制临床转化。

SMARCB1。SMARCB1编码SWI/SNF相关基质关联肌动蛋白依赖性染色质调节因子亚家族B成员1（SMARCB1），SWI/SNF染色质重塑复合体的核心亚基，通过调节核小体定位调控转录。通过其在染色质可及性中的作用，SMARCB1影响控制细胞分化和增殖的基因表达程序。SMARCB1丧失是恶性横纹肌样肿瘤和几种其他侵袭性癌症的特征，通常通过双等位基因失活或缺失。SMARCB1缺陷肿瘤表现出广泛的表观遗传失调和对补偿通路的依赖性，包括PRC2/EZH2信号传导。虽然EZH2抑制剂利用这一脆弱性，但它们不恢复正常的染色质重塑功能。相反，直接SMARCB1替代可以更全面地解决潜在表观遗传缺陷。与其他肿瘤抑制靶点相比，研究人员对SMARCB1替代的关注相对较少。迄今为止，唯一由明确定义的治疗平台支持的SMARCB1替代策略使用免疫脂质体纳米复合物，封装编码SMARCB1的质粒并装饰有肿瘤靶向部分。研究人员在非典型畸胎样横纹肌样瘤的体外和体内模型中评估了该基因疗法，观察到作为单药治疗的有前景的抗肿瘤活性，与化疗或放疗联合时功效更大。鉴于其在染色质重塑中的核心作用和SMARCB1缺陷肿瘤的侵袭性生物学，SMARCB1仍然是基于基因替代疗法的有前景靶点。未来努力应集中于改善肿瘤靶向和支持持久转基因表达的递送策略。

CDKN2A。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（CDKN2A）是双编码基因，通过交替阅读框编码两种不同的肿瘤抑制蛋白：p16^INK4a和p14^ARF。p16^INK4a抑制细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4和CDK6，从而阻止pRb磷酸化并强制G1细胞周期停滞。p14^ARF通过拮抗MDM2介导的降解稳定p53，将CDKN2A连接到pRb和p53肿瘤抑制通路。CDKN2A在多种癌症中频繁发生纯合性缺失，包括黑色素瘤、胰腺癌和非小细胞肺癌。CDKN2A丧失导致不受控制的CDK4/6活性和细胞周期进展。临床上，CDK4/6抑制剂部分补偿CDKN2A丧失，但其疗效依赖于完整pRb功能且常常受耐药机制限制。这些限制突显了靶向该通路的复杂性，并表明恢复上游调控控制可能提供互补治疗获益。尽管CDKN2A改变是人类癌症中最常见的基因组事件之一，但尚无CDKN2A替代疗法进入临床。然而，研究人员广泛研究了基于CDKN2A单个基因产物的基因替代策略，特别是p16^INK4a和p14^ARF。腺病毒p16^INK4a基因疗法已在众多癌症模型中评估，包括头颈癌、前列腺癌、脑癌、乳腺癌、肺癌和胰腺癌。类似地，研究人员在多种癌症类型中广泛研究了腺病毒p14^ARF基因疗法。虽然p16^INK4a和p14<