《Frontiers in Veterinary Science》：Blood parameters of wild-caught harbor seals (Phoca vitulina) in the German North Sea: reference intervals and potential influencing factors
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摘要
参考区间是康复中或永久人工饲养条件下港海豹（Phoca vitulina）诊断评估和治疗决策的基础，同时也是评估自由放归个体健康状况、进而推断种群健康水平的重要工具。然而，目前基于自由放归且表现健康状况良好的个体所建立的可靠数据集仍较为稀缺。本研究评估
摘要
参考区间是康复中或永久人工饲养条件下港海豹（Phoca vitulina）诊断评估和治疗决策的基础，同时也是评估自由放归个体健康状况、进而推断种群健康水平的重要工具。然而，目前基于自由放归且表现健康状况良好的个体所建立的可靠数据集仍较为稀缺。本研究评估了在德国北海野生捕获的576只港海豹的14项血液学参数和21项血清生化参数的参考值，样本采集时间跨度近三十年。在剔除离群值后，根据各参数的样本量采用非参数方法或自助法（bootstrap）估计95%参考区间及其90%置信区间。此外，研究人员还采用Mann–Whitney-U检验考察了三个因素及各参数潜在时间趋势的影响。结果显示，年龄组、性别和季节仅对少数血液参数产生中等程度影响：幼年个体的乳酸脱氢酶（LDH）水平高于多年生个体，而多年生个体的肌酐水平更高；雌性个体的铁、血尿素氮（BUN）和甘油三酯水平高于雄性；春季测得的红细胞分布宽度（RDW）、总蛋白和胆固醇水平高于秋季。所有血液参数均未发现随时间变化的特定趋势。本研究增进了对自由放归港海豹血液参考值的认识，为瓦登海港海豹种群的进一步健康评估提供了重要的基线数据。对自由放归海洋哺乳动物种群进行持续健康检查，是识别潜在威胁的重要早期预警手段，可为有效的管理和保护措施提供宝贵信息。
题目：德国北海野生港海豹血液参考区间的建立及影响因素分析
一、研究背景
港海豹（Phoca vitulina）是三方瓦登海地区两种常驻海豹物种之一。二十世纪，由于捕猎活动，瓦登海港海豹种群数量出现严重下降。在国家与国际保护措施实施后，种群开始恢复，但随后又遭受了两次犬瘟热病毒疫情（1988/1989年和2002年）及一次甲型流感疫情（2014年）的冲击。尽管过去十年种群数量维持在较高水平并保持稳定，但近期观察提示种群数量出现不明原因的轻微下降。特别是幼崽补充进入繁殖年龄组的比例大幅降低，表明幼崽在出生后第一年的存活率较低，这也凸显了对该海豹种群进行持续监测的必要性。
血参数在人和兽医临床医学中被广泛用于健康评估，且已成功应用于包括海洋哺乳动物在内的野生动物种群健康状态评价。然而，获取具有统计学稳健样本量的生理健康参考值仍存在挑战。年龄组、性别、季节、繁殖状态、地理位置和饮食等多种内在因素均可影响血参数。此外，若参考值来自健康状态受损的动物（如康复中心的动物）则可能产生偏倚。现有港海豹血参考区间对于野生种群健康评估的价值有限，因为野生种群中老年动物占主导，而已发表的血液值大多来自康复中心的幼崽，少数研究包含康复或圈养环境中的老年动物，自由放归港海豹采样也主要以幼崽为主。因此，基于野生、老年港海豹的血液参考值对于准确评估种群健康至关重要。
二、研究内容
研究人员对1997年至2024年间在德国石勒苏益格-荷尔斯泰因州瓦登海地区三个不同地点（Lorenzensplate和Kolumbusloch两个沙洲以及黑尔戈兰岛）通过健康监测捕获的576只自由放归港海豹进行了血液学和血清生化检测。样本涵盖幼年组（约2至18月龄）和多年生组（19月龄及以上），性别分布均衡，主要采样季节为春季和秋季。研究共收集35项参数，包括红细胞（RBC）、血红蛋白（Hb）、血细胞比容（HCT）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞分布宽度（RDW）、血小板、平均血小板体积（MPV）、白细胞（WBC）、粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、总蛋白、白蛋白、球蛋白、血清葡萄糖、甘油三酯、血尿素氮（BUN）、尿素、肌酐、总胆红素、胆固醇、碱性磷酸酶（ALP）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）、α-淀粉酶、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、钙、无机磷、钠、钾和铁等。该研究旨在建立基于野生、以成年个体为主的参考区间，并探讨年龄、性别、季节及时间趋势对血参数的影响。论文发表在《Frontiers in Veterinary Science》。
三、主要技术方法
研究遵循美国兽医临床病理学学会（ASVCP）2011年共识指南进行数据分析。首先通过箱线图、直方图和正态曲线目视识别离群值，采用Horn方法（部分参数辅以Tukey方法）进行离群值剔除。参考区间（RI）及置信区间（CI）使用R软件的“referenceIntervals”包计算，样本量≥120时采用非参数方法，样本量<120时对CI采用自助法（bootstrap）。采用主成分分析（PCA）和置换多元方差分析（PERMANOVA）考察数据多元结构，采用Shapiro–Wilk检验评估正态性，采用Mann–Whitney-U检验（MWU）比较各因素类别间的差异，并用Wilcox效应量评估差异程度。时间趋势分析将数据按7年间隔（1997–2003、2004–2010、2011–2017、2018–2024）分组进行MWU检验和效应量评估。因冬季样本量过小（n=16），该季节数据被排除于因素分析之外。
四、研究结果
4.1 参考区间
研究基于576只野生港海豹的血样，计算了35项血液参数的95%参考区间及其90%置信区间。其中，红细胞数的参考区间为3.91~5.48 T/L，血红蛋白为16.50~23.00 g/dL，血细胞比容为44.11~55.35%，白细胞为5.40~13.80 G/L，总蛋白为7.10~8.20 g/dL，肌酐为53.05~135.63 μmol/L，LDH为465.75~1292.25 U/L。各项参数的离群值剔除比例在0.0%至25.4%之间。研究还比较了与其他研究的差异：与本研究的CC（confidence interval, CI）相比，RDW、MPV、ALT、ALP和无机磷在其他研究中普遍高于本研究，而粒细胞、嗜酸性粒细胞和肌酐则低于本研究。
4.2 影响因素
多变量分析（PERMANOVA）显示，性别与季节的交互项对血液学参数（Pr(>F)=0.0061）和血清生化参数（Pr(>F)=0.0183）均有统计学显著性。成对比较和效应量分析表明：年龄组仅对LDH和肌酐产生影响——幼年组LDH值高于多年生组，而肌酐值则低于多年生组；性别仅对甘油三酯产生影响——雌性高于雄性；季节对8项血液参数产生影响——RBC、Hb和HCT在秋季和春季高于夏季，RDW在秋季高于春季和夏季，粒细胞计数在春季高于夏季，总蛋白在春季高于秋季和夏季，钙在春季低于夏季，胆固醇在春季的中位数更低而参考区间更宽。
4.3 时间趋势
在四个7年时间区间的比较中，仅MCV（平均红细胞体积）和淋巴细胞百分比显示出轻微但持续的随时间变化趋势：MCV呈轻微上升，淋巴细胞百分比呈轻微下降，且两者均有超出参考区间的情况。其余参数无连续时间趋势，但部分参数在不同时间段之间存在差异。研究人员对这些差异与检测设备和实验室变更的时间进行了对应分析，发现血液学参数在首次分析仪更换时段存在Hb、MCH、MCHC和粒细胞的轻微差异，而生化参数在实验室变更期间有多项指标显示出区间差异。
五、讨论与结论
讨论部分指出，本研究基于576只自由放归港海豹的独特大型数据集，建立了血液学和血清化学参考区间，动物采样覆盖德国瓦登海三个地点、历时28年。由于三方瓦登海的港海豹被视为单一种群，且三个采样点均位于已知栖息地范围内，因此数据合并处理是合理的。本研究的参考区间与以往不同年龄和不同地域港海豹的报道值总体一致，差异主要体现在RDW、MPV、ALT、ALP、磷（高于本研究）以及粒细胞、嗜酸性粒细胞、肌酐（低于本研究）。与基于英国成年自由放归港海豹的研究相比，本研究中瓦登海种群的ALT（23~118.7 U/L对比2.54~66.85 U/L）和ALP（13.55~102 U/L对比6.14~45.59 U/L）明显较高。
研究结论指出，本研究为自由放归港海豹的血常规和血液生化值提供了宝贵的参考区间。这些参考区间与先前报道的港海豹血液值总体一致，但反映了种群特异性。研究还表明，相较于性别和两个年龄组，季节因素对血参数的影响更大。这些数据不仅对个体动物的健康评估至关重要，更有助于补充野生港海豹种群健康状况的信息。与从死亡动物获得的健康数据相比，从野生捕获动物获得的临床参数能够额外评估非致死性和慢性健康状况，并增进对成年和健康个体年龄组的了解。因此，该数据代表了重要的早期预警工具，能够在死亡率上升之前发现健康状况下降的迹象。此外，研究人员强调需要对各海豹种群进行持续监测，因为不同栖息地可能通过猎物种类差异或应激水平等因素影响血液值。随着人为活动和压力的增加，活体个体健康监测是物种保护和管理决策的重要工具。
