GPER与EGFR串扰揭示醛固酮和MR拮抗剂诱导培养内皮细胞产生NO

《Frontiers in Pharmacology》：GPER and EGFR cross-talk highlight aldosterone- and MR antagonist-induced NO production in cultured endothelial cells

　　

引言：醛固酮诱导大鼠肠系膜血管系统快速的非基因组血管舒张，盐皮质激素受体（MR）拮抗剂广泛用于心血管疾病，然而其在经典MR阻断之外的药理学特征仍不清楚。研究人员检验了与表皮生长因子受体（EGFR）功能性偶联的G蛋白偶联雌激素受体（GPER/GPR30）是否介导醛固酮作用中快速的内皮一氧化氮（NO）组分，以及MR拮抗剂是否表现出内在的GPER相关活性。方法：在去甲肾上腺素预收缩的离体灌注大鼠肠系膜动脉床中评估醛固酮诱导的血管舒张，并通过DAF-FM荧光法在原发性肠系膜内皮细胞培养物中定量NO产生，同时设置经过验证的溶剂对照。通过选择性药理学工具和内皮去除，探究了螺内酯、依普利酮和非奈利酮所涉及的机制。基于人GPER冷冻电镜（cryo-EM）模板构建的大鼠GPER比较模型，通过分子对接探索配体识别。结果：醛固酮诱导浓度依赖性内皮NO产生（EC₅₀ = 2.26 ± 0.3 nM）和血管舒张（EC₅₀ = 0.9 ± 0.2 nM），两者密切相关（R² = 0.969，p < 0.01）。所有三种MR拮抗剂均阻断醛固酮反应，但每种拮抗剂在无醛固酮存在时也各自诱导内在的、浓度依赖性NO产生，其中依普利酮和螺内酯显示出比非奈利酮更高的内在效能。用100 nM GPER拮抗剂G-36或100 nM AG-1478预处理可显著减弱醛固酮诱导的DAF-NO信号和血管舒张，而内皮去除或L-NAME则将血管舒张逆转为血管收缩。醛固酮信号传导还依赖于PI3K、PKA和IP₃受体门控的Ca²⁺动员。对接分析确定了合理的受体结合构象，其中甾体类配体汇聚于共享空腔，而非奈利酮采用不同的结合模式。讨论：MR拮抗剂通过G-36敏感的、与EGFR信号功能性偶联的GPER相关通路诱导内皮NO产生，而非在此情境中作为纯竞争性拮抗剂发挥作用。由于近期cryo-EM研究揭示了非经典的细胞外GPER结构，对接结果被解释为结构上合理的相互作用场景，而非确定的正构位点归属；该行为究竟反映了GPER的直接部分激动作用，还是GPER依赖的间接机制，仍有待直接结合研究加以证实。这些发现拓展了当前对MR拮抗剂药理学特征的认识。

**论文解读：GPER与EGFR串扰揭示醛固酮和MR拮抗剂诱导培养内皮细胞产生NO**

**一、研究背景与科学问题**

醛固酮是主要的盐皮质激素，除经典的肾脏钠潴留基因组效应外，还能在数秒至数分钟内引发快速的非基因组心血管效应，包括血管舒张和内皮功能调节，其中一氧化氮（NO）是核心介质。G蛋白偶联雌激素受体（GPER，亦称GPR30）是一种七次跨膜受体，可激活PI3K/Akt、MAPK/ERK和钙动员等多种信号通路；近年冷冻电镜（cryo-EM）研究揭示了人GPER独特的细胞外结构域和非经典配体识别机制，而放射性配体结合实验已证实醛固酮是GPER的直接配体（Ki = 22 nM）。盐皮质激素受体（MR）拮抗剂——螺内酯、依普利酮和非奈利酮——是心力衰竭、高血压和慢性肾脏病的基石治疗药物，但它们在经典MR阻断之外的药理学特征，尤其是是否具有GPER相关内在激动活性，此前尚不清楚。本研究旨在阐明GPER与表皮生长因子受体（EGFR）的串扰是否介导醛固酮的快速内皮NO产生，并评估三种临床使用的MR拮抗剂是否具有内在的GPER相关活性。

**二、研究内容与主要结论**

研究人员在离体灌注大鼠肠系膜动脉床和原代肠系膜内皮细胞中，结合DAF-FM荧光检测、选择性药理学工具和分子对接，发现醛固酮以浓度依赖方式诱导内皮NO产生和血管舒张，两者高度相关；三种MR拮抗剂虽能阻断醛固酮反应，但自身均表现出G-36敏感的、浓度依赖的内在NO产生活性，提示其作为GPER部分激动剂发挥作用。该研究发表在《Frontiers in Pharmacology》。

**三、主要技术方法**

本研究使用雄性Sprague-Dawley大鼠（250–300 g，来源于智利圣地亚哥大学动物设施）。主要方法包括：①离体灌注肠系膜动脉床血管反应性测定；②胶原酶消化法原代培养大鼠肠系膜内皮细胞；③DAF-FM荧光探针结合激光共聚焦显微镜定量单细胞内NO产生；④选择性药理学工具（G-36、AG-1478、wortmannin、H-89、地美司琼斯汀B等）解析信号通路；⑤基于人GPER cryo-EM模板（PDB ID: 8X0F）构建大鼠GPER比较模型，利用OEDocking套件进行分子对接，并以PRODIGY-LIG估算预测结合亲和力。

**四、研究结果**

**3.1 醛固酮诱导培养内皮细胞产生NO**：醛固酮（0.1 nM–1 μM）浓度依赖性增加DAF-NO荧光信号，NO产生EC₅₀为2.26 ± 0.3 nM；在去甲肾上腺素预收缩的肠系膜动脉床中诱导快速短暂的血管舒张，EC₅₀为0.9 ± 0.2 nM，最大反应为33% ± 5%；NO产生与血管舒张高度相关（R² = 0.969，p < 0.01）。内皮去除或eNOS抑制剂L-NAME预处理后，醛固酮反应由血管舒张逆转为短暂血管收缩。

**3.2 MR拮抗剂阻断醛固酮反应但具有内在活性**：螺内酯（5 μM）、依普利酮（2 μM）和非奈利酮（0.1 μM）均显著抑制醛固酮诱导的NO产生和血管舒张，其中非奈利酮以20倍更低浓度达到同等阻断效果，提示其阻断效力更高。值得注意的是，三种MR拮抗剂在无醛固酮存在时均自身诱导浓度依赖性NO产生，提示其具有内在激动活性。

**3.3 MR拮抗剂内在活性呈浓度依赖性且符合部分激动特征**：在10–1,000 nM浓度范围内，MR拮抗剂的内在NO产生活性呈浓度依赖性；依普利酮效能最高（较醛固酮仅低10倍），螺内酯次之，非奈