单次使用生物反应器袋材料对重组腺相关病毒生产用草地贪夜蛾细胞扩增的影响

《Biotechnology Progress》：Impact of single-use bioreactor bag materials on Spodoptera frugiperda cell expansion for recombinant adeno-associated virus manufacturing

用于基因治疗的重组腺相关病毒（rAAV）生产常依赖草地贪夜蛾9（Sf9）昆虫细胞-杆状病毒感染平台，工艺涵盖从摇瓶经中间规模生物反应器至大规模生产的细胞扩增。该过程的关键挑战在于扩增期细胞增殖不佳，显著影响后续病毒生产。研究人员评估了不同单次使用生物反应器袋对Sf9细胞生长的影响，聚焦两类潜在问题：Sf9细胞与袋材不相容，以及袋中可提取物与浸出物（E&L）。单次使用摇床运动（RM）生物反应器袋构型（含材料与表面相关属性）与Sf9扩增性能差异显著相关。摇瓶中生长动力学与Pall Allegro XRS系统相当，而Cytiva Cellbag中观察到生长速率降低与增殖延迟。摇瓶与XRS系统生长可比、且Cellbag中调整摇床参数后无恢复，提示袋相关材料与表面因素（而非单纯摇床运动）对生长差异贡献显著。较低装袋率进一步加剧生长抑制。洗涤研究示新袋无改善，初次使用后部分恢复提示短暂袋 conditioning 或表面相关效应。未进行分析性E&L谱学分析，故不能全然排除浸出物介导贡献。这些发现凸显单次使用袋选择与装袋率优化对稳健可放大Sf9扩增工艺的重要性。

研究背景与立项依据

重组腺相关病毒（rAAV）是基因治疗的重要载体，其生产广泛采用Sf9昆虫细胞-杆状病毒表达平台。工艺通常由摇瓶扩增起步，经中间规模单次使用摇床运动（RM）生物反应器（如Wave式系统）放大至生产规模。尽管单次使用袋技术具备低污染风险、低资本投入与高灵活性等优势，但袋膜材料化学属性（聚乙烯PE、乙烯-醋酸乙烯酯EVA、热塑性弹性体TPE等接触层）及可提取物与浸出物（E&L，extractables and leachables）可能影响细胞相容性。已有研究多关注哺乳动物细胞（如CHO、NS0）对Irgafos 168降解产物bDtBPP的敏感，而昆虫细胞Sf9在RM袋中的材料相容性知识存在缺口：已发表Sf9 RM研究多基于EVA或EVA/LDPE膜，新型PE基接触层（如LLDPE、ULDPE）的影响尚未系统评估。本研究由Motevalian与Park发表于《Biotechnology Progress》，旨在明确RM袋构型（材料、几何、装袋率、平台）对Sf9扩增的影响，区分摇床运动与袋相关因素的贡献，为rAAV工艺放大提供材料选型依据。

主要技术方法概括

研究人员采用Thermo Fisher Sf9细胞株，于28℃非CO₂摇瓶（108 rpm）中以Sf-900 III SFM扩增作为接种源；在Pall Allegro XRS（二维摇动、ULDPE接触层Allegro TK8袋）与Cytiva RTP WAVE 25（一维摇动）平台上分别测试Cytiva Cellbag（BioClear 11，EVA/LDPE接触层）、定制Sartorius Flexsafe 50 L（S80膜，LLDPE接触层）及Pall原厂XRS袋；采用两阶段扩增（低体积起始→补料至半袋容），装袋率定义为工作体积/袋总容量（8%–50%区间）；以Vi-Cell XR计数活细胞密度（VCD）与活力，按指数期ln(VCD)-时间斜率算比生长速率μ与倍增时间T_d，JMP软件做ANOVA与Tukey–Kramer HSD；另设Cellbag介质预孵洗脱转摇瓶、新袋预洗回用、旧袋复用三类机制实验，均未做LC–MS/ICP等E&L分析。

研究结果（按原文小节）

3.1 摇瓶扩增前阶段：Sf9复苏后传代，第一传代μ（0.68 day^?1，T_d 24 h）显著低于第二（0.74，23 h）、第三传代（0.76，22 h），活力均>96%，表明复苏后一代即稳态，摇瓶基线μ≈0.74–0.76 day^?1。

3.2 不同RM袋构型下细胞生长差异：Pall XRS两阶段μ分别为0.77与0.74 day^?1（T_d≈22 h），与摇瓶相当；Cytiva Cellbag 10 L袋装1 L（10%装袋率）首阶段μ仅0.23±0.03 day^?1（T_d 74 h）且活力下降，20 L袋装4 L（20%）μ 0.59–0.66（T_d 27 h），装10 L（50%）单跑T_d 24 h；定制Flexsafe 50 L在8%–10%装袋率首阶段μ 0.58–0.65（T_d 26–29 h），38%–40%装袋率二阶段μ 0.73–0.80（T_d 21–23 h）。调摇床角/速率不能恢复Cellbag生长，表明非摇动模式本身所致。

3.3 定制Flexsafe于Cytiva RTP表现：同平台下Flexsafe早阶段增殖快于Cellbag，二阶段高装袋率T_d逼近XRS；但Flexsafe与Cellbag仍共享RTP一维摇动与不同袋容，无法完全隔离膜化学与几何/装袋率效应。

3.4 介质体积与装袋率效应：装袋率越低（≤10%）Sf9生长越受抑，Cellbag 10%装袋率T_d达74 h，升至20%–50%显著缩短；Flexsafe在≥38%装袋率完全恢复至XRS水平。表明表面/体积比与袋相关表面交互作用关键。

3.5 Cellbag洗涤后生长探究：Cellbag预孵介质转入摇瓶不影响生长；新袋水/介质预洗后回用仍无改善；但经一次完整培养的旧袋（10 L与20 L）二次培养早期仍慢、后期部分恢复，提示完整培养运行可对流体接触面产生conditioning/passivation，而非可水洗转移的可溶抑制物。因缺E&L谱学，不能排除低丰度浸出物或表面结合态extractable贡献。

讨论与结论翻译

讨论指出，袋膜组成未能与几何、平台、装袋率完全解耦——XRS vs Cellbag比较同时改变膜化学、摇动维度、几何与控制器；同平台Cellbag vs Flexsafe仍差袋容与装袋区间，故应视作系统级关联而非单一膜化学结论。洗涤/复用实验最契合“短暂、培养conditioned的表面相关效应”，但E&L机制未排除。

结论部分译文：本研究显示单次使用RM生物反应器袋构型（含材料与表面相关属性）与Sf9扩增性能差异显著相关。Sf9在摇瓶与Pall Allegro XRS中生长一致，而在部分Cellbag构型（尤低装袋率）中生长速率降低、增殖延迟。结果表明摇→RM转换本身在测试条件下未损生长；但因膜组成、平台、几何与装袋率未全解耦，差异应谨慎归于袋与表面相关属性（含膜化学）而非混合模式单独作用。抑制在接种后立即显现且低装袋率加重，凸显表面/体积比与材料-细胞交互重要性。洗涤与复用示：新袋预孵介质转摇瓶无抑制、新袋预洗不恢复、旧袋一次培养后改善，符合短暂培养conditioned表面效应；因未做E&L分析不能全排除浸出物。该袋依赖性扩增差异对杆状病毒/Sf9-rAAV制造具实际影响：最差袋条件未达感染前VCD判据致无法进病毒生产，较轻者延长时间线增风险。总体凸显Sf9工艺开发中选袋与操作条件优化对稳健放大的意义。