《Journal of Chromatography B》：Simultaneous analysis of 40 pyrrolizidine alkaloids in herbs and spices by supercritical fluid chromatography-tandem mass spectrometry
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•建立了一种用于测定香草和香料中 PAs/PANOs 的 SFC–MS/MS 方法。•使用 3-羟基苯基柱同时测定了 40 种 PAs/PANOs。•我们分析了市售样品，发现部分样品含有高水平的 PAs/PANOs。引言吡咯里西啶生物碱 (PAs) 及其 N-氧化物 (PAN
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建立了一种用于测定香草和香料中 PAs/PANOs 的 SFC–MS/MS 方法。
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使用 3-羟基苯基柱同时测定了 40 种 PAs/PANOs。
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我们分析了市售样品，发现部分样品含有高水平的 PAs/PANOs。
引言
吡咯里西啶生物碱 (PAs) 及其 N-氧化物 (PANOs) 是主要存在于菊科、紫草科和豆科植物中的天然毒素 [1]。PAs/PANOs 通常具有两个共用一个氮原子的稠合五元环。特别是 1,2-不饱和 PAs/PANOs 具有毒性。它们在肝脏中代谢为有毒化合物，能够与 DNA 和蛋白质结合，从而导致肝毒性、遗传毒性和致癌性 [2]。PAs/PANOs 引起的典型综合征是肝静脉闭塞病 (HVOD)，这是 PA/PANO 毒性的指标 [3]。据报道，阿富汗、伊拉克和印度发生了与谷物中 PA/PANO 污染相关的 HVOD 疫情 [4], [5], [6]。也有报道称，摄入含有 PAs/PANOs 的香草和香料会导致中毒，部分病例导致死亡 [7]。
欧盟于 2020 年设定了 PAs/PANOs 的最大限量。这些限量为：琉璃苣、藁本、马郁兰和牛至 1000 μg/kg，其他香料 400 μg/kg [8]。欧盟食品和饲料快速预警系统 (RASFF) 发布的许多警报与香草和香料有关，尤其是牛至和孜然。多项研究表明，各种香草和香料中含有 PAs/PANOs [9], [10], [11]。因此，测定香草和香料中的 PA/PANO 含量对于降低与这些化合物相关的健康风险至关重要。
液相色谱 - 串联质谱 (LC-MS/MS) 结合反相色谱柱（如 C18 或 C8）常用于测定食品基质中的 PAs/PANOs [1], [9], [11], [12], [13], [14]。然而，许多 PAs/PANOs 具有结构相似的异构体，这使得 PA/PANO 异构体的完全色谱分离变得复杂。也有报道将反相色谱与另一种分离技术——亲水相互作用液相色谱相结合，允许单独测定 33 种 PAs/PANOs [15]。最近，使用 C18 柱通过 LC-MS/MS 实现了 36 种 PAs/PANOs 的完全分离 [11]。
PAs/PANOs 色谱分离的另一种方法是超临界流体色谱 (SFC)。SFC 使用超临界流体，通常是二氧化碳 (CO2)，作为流动相。超临界 CO2 作为非极性溶剂，但可以与极性有机溶剂（如甲醇或乙腈）混合，后者称为改性剂。改性剂改变流动相的极性，通过结合超临界 CO2 和改性剂可以控制分离。SFC 的这一特性允许对广泛化合物进行全面分离。此外，超临界流体的粘度低于液体，扩散性高于液体。因此，SFC 能够在相对较低的回压下实现快速和高分辨率分析，并用于手性分离、代谢组学、脂质组学和农药分析 [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23]。此外，SFC 中使用的 CO2 通常来源于其他工业的副产品，与产生大量废水废料的反相 LC 相比，将其作为主要流动相可以减少溶剂废料的体积。然而，尽管有这些优势，关于在 PA/PANO 分析中使用 SFC 的研究很少。Holzer 等人报道了一种毛细管 SFC 结合火焰离子化检测方法，可同时分析八种 PAs [24]。Zwerger 等人建议使用 SFC-MS 方法同时分析六种 PAs/PANOs [25]。使用直链淀粉三 (3-氯 -5-甲基苯基氨基甲酸酯) 手性柱完成了 34 种 PAs/PANOs 的同时测定 [26]。然而，该方法并未涵盖欧盟法规列出的所有 35 种 PAs/PANOs。据我们所知，尚未报道适用于广泛 PAs/PANOs（包括受管制的 35 种 PAs/PANOs）的 SFC 方法。本文报告了一种适用于同时测定香草和香料中 40 种 PAs/PANOs（包括受管制的 35 种 PAs/PANOs）的 SFC–MS/MS 方法。
章节摘要
试剂和标准品
CO2 (99.5%) 购自日本神奈川县东邦酸素工业。甲酸铵 (HPLC 级) 和甲醇 (LC/MS 级) 购自日本大阪富士胶片和光纯药。氨溶液和硫酸购自德国达姆施塔特默克。水/甲醇混合溶液 (1:1, v/v) 购自日本东京关东化学。0.1 v/v% 甲酸甲醇溶液 (LC/MS 级) 购自美国新泽西州 Morris Plains Solstice 先进材料。PA/PANO
色谱条件优化
我们基于 Grüning 等人报道的方法开发了 SFC 方法 [26]。他们的方法使用了 CHIRALPAK IG-3 柱 (Daicel) 和三元流动相系统，由 CO?、甲醇中的 50 mM 甲酸铵和甲醇组成，并以 0.1% 甲酸作为补充溶剂。因为我们的 SFC 系统只配备了两个溶剂泵，我们优化了二元流动相系统，包括其组成和梯度程序。此外，代替手性固定相
结论
我们建立了一种测定香草和香料中 PAs/PANOs 的 SFC–MS/MS 方法。使用含甲酸铵的甲醇改性剂梯度的 3-羟基苯基柱实现了 40 种 PAs/PANOs 的同时测定，尽管有些对仅部分分离。验证结果表明了本方法的可靠性和重现性。通过对香草和香料中 PAs/PANOs 的定量，我们发现一些样品含有高水平的
CRediT 作者贡献声明
望月 龙: 写作 – 初稿，验证，方法论，调查，概念化。 斋藤下 静香: 写作 – 审查与编辑，监督，项目管理。 铃木 利之: 写作 – 审查与编辑，资金获取。 堤 友昭: 写作 – 审查与编辑，监督，资源，项目管理。
竞争利益声明
作者声明，他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本研究由 日本厚生劳动省 资助 (资助编号：JPMH24KA1001)。
望月 龙 | 斋藤下 静香 | 铃木 利之 | 堤 友昭
