《Journal of Ginseng Research》：Ginsenoside Rd alleviates atherosclerosis by inhibiting adipocyte ferroptosis in perivascular adipose tissues
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背景：人参皂苷Rd（Rd）是 Panax ginseng Meyer 中的一种活性成分，可被吸收进入脂肪组织。本研究旨在探讨Rd对动脉粥样硬化（AS）的影响并阐明其作用机制。方法：研究人员通过给予ApoE-/-小鼠标准西方高脂饮食构建AS
背景：人参皂苷Rd（Rd）是 Panax ginseng Meyer 中的一种活性成分，可被吸收进入脂肪组织。本研究旨在探讨Rd对动脉粥样硬化（AS）的影响并阐明其作用机制。方法：研究人员通过给予ApoE-/-小鼠标准西方高脂饮食构建AS模型，给予Rd处理，并联合应用RORC和TIGAR脂肪细胞特异性腺相关病毒感染。通过脂多糖（LPS）诱导炎症性脂肪细胞模型（3T3-L1），通过棕榈酸诱导脂肪细胞脂质蓄积模型。研究人员借助慢病毒载体和铁死亡激活剂erastin，探讨了Rd介导的RORC/TIGAR轴在脂肪细胞炎症、氧化应激和铁死亡中的作用，并检测了RORC与TIGAR之间的相互作用。随后，评估了小鼠和3T3-L1细胞中血管周围脂肪组织（PVAT）内的脂质过氧化和铁死亡程度。结果：Rd改善了AS小鼠的PVAT功能障碍并缓解了内皮炎症。人参皂苷Rd靶向并抑制小鼠PVAT内脂肪细胞中RORC的表达。转录因子RORC占据TIGAR启动子以抑制TIGAR转录。RORC的重新激活逆转了Rd对AS的治疗获益，而TIGAR的重新激活也缓解了由RORC加剧的AS。Rd通过抑制PVAT内脂肪细胞中RORC表达、削弱其对TIGAR的抑制作用，并进一步抑制脂肪细胞铁死亡，从而实现治疗获益。结论：Rd靶向RORC以激活TIGAR表达并阻断PVAT中脂肪细胞铁死亡，从而抑制AS。
**论文解读：人参皂苷Rd通过RORC/TIGAR轴抑制血管周围脂肪组织脂肪细胞铁死亡以缓解动脉粥样硬化**
**一、研究背景与科学问题**
动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）是心血管疾病及其相关血管疾病的主要驱动因素，本质上是一种病因未明的炎症性疾病，以血管内皮功能障碍、炎性细胞募集、脂质氧化和泡沫细胞形成为主要特征。血管周围脂肪组织（perivascular adipose tissue, PVAT）作为心外膜脂肪组织包绕冠状动脉血管的组成部分，环绕绝大多数血管，通过释放脂肪细胞因子与邻近血管直接通讯，从而调控血管功能。PVAT通过释放脂联素（adiponectin）、apelin、瘦素（leptin）和omentin等因子发挥血管舒张、抗氧化和抗炎作用，这些因子可直接作用于血管平滑肌细胞，或间接增强内皮源性血管舒张因子和内皮源性超极化因子的产生。因此，阐明PVAT调控AS的复杂机制有望改善AS的临床管理。
人参（Panax ginseng Meyer）的干燥根是中国及东南亚地区应用最广泛的中药材之一。人参皂苷（ginsenosides）是一类与糖链相连的三萜类皂苷。人参皂苷Rd（ginsenoside Rd, Rd）属于原人参二醇型人参皂苷，具有抗癌、抗糖尿病、抗炎、心脏保护和免疫调节等多种药理活性。既往研究显示，Rd以20 mg/kg/天（腹腔注射）剂量可显著减少高脂饮食ApoE
-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块面积和氧化型低密度脂蛋白摄取，但该研究主要聚焦于巨噬细胞的作用，Rd对PVAT的影响尚不清楚。维A酸相关孤儿受体γ（retinoid-related orphan receptor gamma, RORC）是核受体超家族成员，其过表达可导致肥胖相关胰岛素抵抗和多种自身免疫性疾病。抑制RORC介导的IL-17A表达可抑制饮食诱导的肥胖和代谢紊乱，促进脂肪组织褐变、产热和能量消耗。TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator, TIGAR）主要定位于细胞质，在应激条件下可转位至细胞核和其他细胞器，支持DNA修复并降低细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平，从而维持能量代谢平衡。基于上述背景，本研究旨在探讨Rd通过RORC/TIGAR轴对PVAT的作用，为AS的治疗策略提供新视角。
**二、研究内容与主要结论**
研究人员构建了AS小鼠模型（ApoE
-/-小鼠给予标准西方饮食），并给予不同剂量Rd处理，同时结合RORC和TIGAR脂肪细胞特异性腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）感染。体外实验中，利用脂多糖（LPS）诱导3T3-L1脂肪细胞炎症模型，棕榈酸诱导脂肪细胞脂质蓄积模型，并通过慢病毒载体和铁死亡激活剂erastin研究Rd介导的RORC/TIGAR轴在脂肪细胞炎症、氧化应激和铁死亡中的作用。
研究结果表明，Rd改善了AS小鼠的PVAT功能障碍并缓解了内皮炎症。Rd靶向并抑制PVAT内脂肪细胞中RORC的表达，RORC作为转录因子占据TIGAR启动子以抑制其转录。RORC的重新激活逆转了Rd对AS的治疗获益，而TIGAR的重新激活则缓解了由RORC加剧的AS。Rd通过抑制PVAT内脂肪细胞中RORC表达、削弱其对TIGAR的抑制作用，进一步抑制脂肪细胞铁死亡，从而实现对AS的抑制作用。该研究揭示了Rd通过靶向RORC激活TIGAR表达并阻断PVAT中脂肪细胞铁死亡从而抑制AS的新机制，为AS的治疗提供了新的潜在靶点。该论文发表在《Journal of Ginseng Research》。
**三、主要关键技术与方法**
本研究采用的主要技术方法包括：基于ApoE-/-小鼠西方饮食喂养构建AS动物模型（动物购自查尔斯河实验室）并进行Rd腹腔注射给药；利用脂肪细胞特异性启动子FABP4（aP2）驱动的AAV载体实现RORC和TIGAR在脂肪组织中的靶向过表达；采用3T3-L1前脂肪细胞分化模型及LPS/棕榈酸诱导的体外炎症和脂质蓄积模型；通过分子对接（Autodock Vina）预测Rd与RORC蛋白的结合；运用细胞热迁移实验（CETSA）和药物亲和响应靶向稳定性实验（DARTS）验证药物与靶蛋白的直接结合；采用染色质免疫沉淀（ChIP）和双荧光素酶报告基因实验验证RORC对TIGAR启动子的转录调控；通过Transwell共培养体系评估PVAT或脂肪细胞对血管内皮细胞（HUVEC）炎症状态的影响；运用Western blot、qPCR、免疫组织化学、免疫荧光、ELISA等技术检测蛋白和基因表达水平及细胞因子分泌。
**四、研究结果**
**1. Rd改善AS小鼠的PVAT功能障碍并缓解内皮炎症**
ApoE-/-小鼠经西方饮食喂养建立AS模型后，AS组小鼠主动脉树和主动脉窦出现动脉粥样硬化病变，不同剂量Rd均可减轻病变程度，其中20 mg/kg剂量治疗效果最佳。AS小鼠PVAT中IL-6、MCP-1、TNF-α和瘦素蛋白水平上调，而omentin和脂联素下调。随着Rd治疗剂量升高，PVAT中炎性因子和瘦素浓度逐渐降低，omentin和脂联素表达得以恢复。将小鼠PVAT与HUVEC共培养后，HUVEC中MCP-1、IL-6、IL-1β含量及VCAM-1和ICAM-1蛋白表达升高，而来自Rd处理的AS小鼠PVAT可缓解HUVEC的炎症反应和功能障碍。
**2. Rd特异性结合并抑制脂肪细胞中RORC活性**
通过对AS小鼠和对照小鼠PVAT进行全基因组建表达分析，筛选差异表达基因（DEGs），并与Rd的蛋白靶点进行交叉筛选，唯一交集为RORC。分子对接显示Rd与RORC蛋白（PDB ID: 6NWT）的结合能为-8.938 kcal/mol，表明结合高度稳定。CETSA和DARTS实验证实Rd可显著增强RORC蛋白的热稳定性和抗蛋白酶消化能力。RORE依赖性荧光素酶报告基因实验表明，Rd可抑制RORC过表达所增强的RORE驱动荧光素酶活性。AS小鼠PVAT中RORC蛋白表达升高，H-Rd处理可降低其表达。在LPS或PA诱导的3T3-L1脂肪细胞中，RORC蛋白表达上调，而Rd可下调其表达，同时抑制IL-6、MCP-1、TNF-α和瘦素水平并增强脂联素水平。
**3. RORC过表达削弱Rd对AS小鼠的改善作用**
在AS建模和Rd给药前向小鼠递送AAV-RORC以在脂肪组织中过表达RORC。RORC过表达上调了小鼠PVAT中RORC表达，在Rd存在下加剧了AS病变和斑块形成，上调IL-6、MCP-1、TNF-α和瘦素水平并降低脂联素表达。这些过表达RORC的PVAT与HUVEC共培养后导致HUVEC炎症反应增强和内皮功能障碍加重。
**4. RORC过表达逆转Rd对脂肪细胞和内皮炎症的抑制作用**
在3T3-L1细胞中通过慢病毒介导RORC过表达后，在LPS或PA诱导下，RORC过表达上调了IL-6、MCP-1、TNF-α和瘦素水平并下调脂联素水平，表明Rd抑制的脂肪细胞炎症被RORC过表达所逆转。RORC上调还升高了与上述脂肪细胞共培养后HUVEC中MCP-1、IL-6、IL-1β浓度及VCAM-1和ICAM-1表达。
**5. RORC结合TIGAR启动子下调TIGAR表达**
通过GEPIA数据库GTEx-脂肪组织样本的Pearson相关性分析发现，脂肪组织中RORC与TIGAR、PTRF、HMOX1、LEP和ACSL3表达显著负相关，其中RORC与TIGAR表达的相关性最强。Cistrome Data Browser的RORC ChIP-seq数据显示TIGAR启动子区存在增强的RORC结合峰。在LPS或PA诱导的脂肪细胞中TIGAR转录和翻译水平下调，而Rd恢复TIGAR表达；RORC过表达在Rd存在下再次下调TIGAR水平。ChIP实验证实抗RORC抗体可富集大量TIGAR启动子片段，RORC过表达增加该富集。RORC过表达还下调了脂肪细胞中TIGAR启动子驱动的荧光素酶活性。
**6. TIGAR过表达削弱AAV-RORC对小鼠AS的加重作用**
在西方饮食喂养和20 mg/kg Rd给药前向ApoE-/-小鼠递送AAV-RORC + AAV-NC或AAV-RORC + AAV-TIGAR。单独AAV-RORC在Rd存在下抑制TIGAR蛋白表达，而脂肪细胞特异性TIGAR过表达恢复了其表达。TIGAR过表达逆转了RORC过表达加速的AS斑块形成，下调IL-6、MCP-1、TNF-α和瘦素水平并上调脂联素水平。TIGAR联合过表达可抑制与这些PVAT共培养后HUVEC中VCAM-1、ICAM-1、MCP-1、IL-6和IL-1β的含量。
**7. TIGAR过表达削弱LV-RORC在脂肪细胞中的促炎特性**
在过表达RORC的脂肪细胞中通过慢病毒进一步过表达TIGAR后，在LPS或PA诱导下，TIGAR过表达下调IL-6、MCP-1、TNF-α和瘦素水平并恢复脂联素水平，有助于缓解共培养后内皮细胞的炎症和功能障碍。
**8. Rd抑制PVAT中脂肪细胞铁死亡以缓解AS进展**
AS小鼠PVAT中ROS含量显著升高，Rd处理降低ROS水平，而联合RORC过表达可逆转这一效应。TIGAR过表达再次降低了AS小鼠主动脉窦中的ROS水平。Rd对PVAT中SOD和GSH含量及铁水平的恢复作用被RORC过表达削弱、被TIGAR过表达增强。PVAT中GPX4和SLC7A11蛋白分析表明，Rd对PVAT的抗铁死亡作用是通过激活TIGAR实现的。
**9. Rd靶向RORC/TIGAR抑制脂肪细胞铁死亡**
在3T3-L1细胞中，Rd抑制LPS诱导的ROS产生。RORC过表达导致ROS水平显著升高，而联合TIGAR过表达进一步下调ROS含量。erastin可增加ROS水平。Rd通过上调抗氧化剂SOD和GSH抑制LPS诱导的脂质过氧化积累，TIGAR过表达逆转了RORC过表达引起的SOD和GSH水平下降，erastin处理导致SOD和GSH水平急剧下降。LPS处理后脂肪细胞出现明显铁积累，Rd可逆转该效应；RORC过表达上调细胞内铁水平，erastin处理增加了被TIGAR上调所降低的细胞内铁水平。LPS对GPX4和SLC7A11的下调被Rd部分逆转，RORC过表达再次降低其表达，erastin在TIGAR过表达存在下降低其表达。C11-BODIPY染色显示LPS增强了3T3-L1脂肪细胞中氧化型绿色荧光信号并增加绿色/红色荧光比值，RORC过表达减弱了Rd对脂质过氧化的抑制作用，TIGAR过表达再次降低了C11-BODIPY氧化信号，erastin处理后脂质过氧化水平再次升高。
**五、讨论与结论总结**
讨论部分指出，炎症机制在动脉粥样硬化斑块形成和进展中发挥重要作用。PVAT位于血管外膜旁，包含成熟脂肪细胞、前脂肪细胞、干细胞和炎性细胞的异质性群体，通过脂肪细胞因子和其他信号分子与血管壁相互作用以调节血管功能。功能失调的PVAT以炎症和氧化应激为特征，保护性脂肪细胞源性松弛因子分泌减少，而瘦素、细胞因子（IL-6和TNF-α）和趋化因子（MCP-1）等旁分泌介质释放增加。本研究证实Rd治疗降低了高脂饮食刺激的ApoE-/-小鼠的PVAT功能障碍并减轻了内皮炎症，伴随RORC下调和TIGAR恢复。AAV-RORC预处理显著抑制了Rd的有利效应，而AAV-TIGAR可逆转该效应。RORC被鉴定为与AS密切相关的基因，在AS小鼠PVAT中表达上调，Rd可逆转这一变化。TIGAR被鉴定为转录抑制因子RORC的靶标，TIGAR敲低可显著促进巨噬细胞脂质积累和ApoE-/-小鼠AS进展。既往研究报道TIGAR可减少脑缺血中的神经元铁死亡，而Rd具有抑制铁死亡的作用。在成熟脂肪细胞中，GPX4活性受损可自发诱发脂质过氧化及TNF-α、IL-1β和IL-6表达。本研究体内和体外实验均表明，Rd对脂肪细胞铁死亡的缓解作用是通过抑制RORC进而激活TIGAR实现的。该研究首次阐明了AS中脂肪细胞铁死亡的分子机制。
研究结论：本研究表明，Rd通过抑制RORC表达、增强脂肪细胞因子分泌和抑制PVAT功能障碍来发挥抗AS作用。此外，RORC介导TIGAR的转录以控制脂肪细胞铁死亡。综上所述，Rd可能是抑制AS的合适治疗药物。
