综述：Cryptolepis sanguinolenta (Lindl.) Schlechter (Apocynaceae) 与 Azadirachta indica (A. Juss) (Meliaceae) 对恶性疟原虫3D7和DD2株的协同组合

《Advances in Pharmacological and Pharmaceutical Sciences》：Synergistic Combination of Cryptolepis sanguinolenta (Lindl.) Schlechter (Apocynaceae) and Azadirachta Indica (A. Juss) (Meliaceae) Against 3D7 and DD2 Strains of Plasmodium Falciparum

　　

引言：印楝（Azadirachta indica）和血红白叶藤（Cryptolepis sanguinolenta）是加纳常用的草药，在多成分草药产品中经常联合使用以治疗疟疾。目的：本研究探讨了印楝（Azadirachta indica）和血红白叶藤（Cryptolepis sanguinolenta）提取物对氯喹敏感（3D7）和氯喹耐药（DD2）恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）株的联合效应。方法：采用基于荧光的SYBR Green检测法测定两种植物水提物的体外抗疟活性。利用计算机软件CompuSyn确定两种提取物的联合效应。结果：印楝（Azadirachta indica）和血红白叶藤（Cryptolepis sanguinolenta）的水提物对恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）3D7和DD2株均表现出高效抗疟活性（半数抑制浓度IC₅₀?≤?10?μg/mL）。印楝（Azadirachta indica）和血红白叶藤（Cryptolepis sanguinolenta）显示出强协同作用，对3D7恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）53%–99%抑制时的组合指数（CI）值范围为0.15至0.52。此外，这两种植物对DD2株的CI值为0.23至0.61，对应30%–97%的寄生虫血症抑制。印楝（Azadirachta indica）和血红白叶藤（Cryptolepis sanguinolenta）在两种株系中的剂量减少指数（DRI）值均大于1（DRI?>?1）。结论：血红白叶藤（Cryptolepis sanguinolenta）和印楝（Azadirachta indica）对恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）3D7和DD2株表现出协同相互作用。联合使用这两种提取物比单独使用更为理想。

1. 引言（Introduction）
疟疾是全球性健康问题，每年影响全球数百万人，经感染疟原虫（Plasmodium）的雌性按蚊叮咬传播。可感染人类的疟原虫有四种，其中恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）导致的病例最为复杂且致死率最高，与间日疟原虫（Plasmodium vivax）合计占所有疟疾病例的95%以上。由于热带气候利于按蚊繁殖，疟疾在该地区广泛流行。世界卫生组织报告显示，全球每年仍有大量新发病例和死亡病例，耐药性寄生虫的出现和传播是当前疟疾控制的主要障碍之一。对奎宁、氯喹、乙胺嘧啶以及当前使用的青蒿素及其衍生物产生耐药性的报道日益增多。组合疗法是克服耐药性进化的常用策略之一，协同药物可同时抑制敏感和耐药株，并在较低剂量下产生显著疗效，减少毒性。本研究采用CompuSyn软件，基于中位效应方程和组合指数（combination index, CI）评估印楝（Azadirachta indica）和血红白叶藤（Cryptolepis sanguinolenta）水提物对氯喹敏感（3D7）和耐药（DD2）恶性疟原虫株的联合效应。
2. 方法学（Methodology）
2.1 材料（Materials）
印楝（A. indica）样品采集自加纳Ayikuma，血红白叶藤（C. sanguinolenta）样品采集自Mampong，经植物学家鉴定并赋予凭证标本号。氯喹耐药（CQR）恶性疟原虫DD2株和氯喹敏感（CQS）3D7株分别来自加纳大学诺古奇纪念医学研究所流行病学系和生物化学系。使用的药物与试剂包括青蒿琥酯（artesunate, ATS）、二甲基亚砜（DMSO）、RPMI 1640培养基、AlbuMAX、次黄嘌呤、SYBR Green 1等。设备包括冷冻干燥机、生物安全柜、离心机、荧光酶标仪、光学显微镜等。
2.2 植物制备与提取（Plant Preparation and Extraction）
植物材料经清洗、阴干七天并粉碎。采用水煎煮法提取：印楝叶煮沸15分钟，血红白叶藤根煮沸30分钟。过滤、旋转蒸发浓缩后冷冻干燥，分别得到32.5 g印楝叶提取物和43.4 g血红白叶藤根提取物，储存于4°C备用。
2.3 植物化学分析（Phytochemical Profiling）
采用标准方法对干燥粉末样品进行植物化学分析，检测是否存在鞣质、生物碱、苷类、皂苷、黄酮类、三萜类及香豆素等次生代谢物。
2.4 体外寄生虫培养与制备（In Vitro Parasite Culturing and Preparation）
采用改良的Trager-Jensen方法建立恶性疟原虫无性期的连续体外培养。培养条件为37°C、93%氮气（N₂）、4%二氧化碳（CO₂）和3%氧气（O₂）。完全培养基含RPMI 1640（10.44 g/L）、HEPES（5.94 g/L）、AlbuMAX II（5 g/L）、次黄嘌呤（50 mg/L）和碳酸氢钠（2.1 g/L），并添加O型阳性人红细胞。每日更换培养基。通过吉姆萨染色薄血涂片监测寄生虫生长，待寄生虫血症超过5%且以环状体为主时，用5% D-山梨醇处理使培养物同步化。随后调整至1%寄生虫血症和2%红细胞压积，作为标准化接种物用于后续实验。
2.5 寄生虫与药物化合物共培养（Plating Parasites With Drug Compounds）
根据先前研究确定的印楝和血红白叶藤提取物半数抑制浓度（IC₅₀）分别为24.48 μg/mL和20.48 μg/mL，用含0.5% DMSO的完全培养基制备工作液。每种提取物按0×、0.0625×、0.125×、0.25×、0.5×和1× IC₅₀的稀释因子制备六个系列浓度，分别针对3D7和DD2株在48孔板中进行三重复实验。培养72小时后，通过吉姆萨染色薄血涂片计数感染红细胞比例，计算平均寄生虫血症。
2.6 联合提取物的抗疟效应（Antiplasmodial Effect of Combined Extracts）
将印楝和血红白叶藤提取物按固定1:1体积比组合，基于各自IC₅₀值进行二倍系列稀释，得到六个组合浓度：0:0、1.305:1.53、2.61:3.06、5.22:6.12、10.44:12.24和20.88:24.48 μg/mL。每个组合浓度在48孔板中三重复，加入同步化的环状体期寄生虫（初始寄生虫血症1%，红细胞压积2%），在37°C、标准气体条件下培养72小时。随后制备薄血涂片并计数，计算平均寄生虫血症。
2.7 联合效应分析（Combination Effect Analysis）
使用CompuSyn软件（Version 1.0）分析联合效应。组合比例为1:1，效应值范围0至1。生成效应-组合指数（Fa-CI）图、剂量减少指数（DRI）图和等bologram图。CI<1、=1和>1分别表示协同、相加和拮抗作用。DRI>1表示有利的剂量减少。
2.8 统计分析（Statistical Analysis）
所有实验均三重复进行，结果以平均值的标准误（SEM）表示。
3. 结果（Results）
3.1 植物样品中检测到的植物化学物质（Phytochemicals Detected in Plant Samples）
印楝叶和血红白叶藤根的提取率分别为3.6%和4.8%。植物化学分析显示，血红白叶藤根中未检出皂苷和植物甾醇；印楝叶中除香豆素外，其余检测的植物化学物质均存在。两种植物均含有黄酮类、鞣质、苷类和生物碱。
3.2 CSE和AZE的抗疟活性（Antiplasmodial Activity of CSE and Azadirachta Indica Extract）
血红白叶藤提取物（CSE）和印楝提取物（AZE）对3D7株的IC₅₀分别为6.12±0.5 μg/mL和5.22±0.6 μg/mL；对DD2株的IC₅₀分别为5.12±0.6 μg/mL和5.12±0.7 μg/mL。阳性对照青蒿琥酯（ATS）对3D7和DD2株的IC₅₀分别为0.003±9×10^-5 μg/mL和0.005±2×10^-5 μg/mL。
3.3 CSE和AZE对3D7和DD2实验室株的联合效应（Combination Effect of CSE and AZE Against 3D7 and DD2 Lab Strains）
针对3D7株，CSE和AZE组合在抑制53%–99%时，CI值为0.15至0.43，显示强协同作用。剂量减少指数（DRI）均大于1，例如在97%抑制时DRI为8.46（CSE）和15.03（AZE），表明可大幅降低单药剂量。针对DD2株，CI值为0.225至0.827，其中在较高抑制水平（83%和97%）时CI分别为0.573和0.225，显示强至高度协同。DRI同样大于1，最高在97%抑制时达38.21（AZE）。等bologram图显示，两种提取物组合在50%、75%和90%抑制水平均落在协同区域。
4. 讨论（Discussion）
植物含有多种生物活性植物化学物质，如生物碱、苷类、类固醇、黄酮类、皂苷等。本研究中两种植物的植物化学分析显示多种成分存在，尤其是生物碱。血红白叶藤根的强抗疟活性与其主要生物碱——吲哚并喹啉类化合物隐黄连碱（cryptolepine）有关。印楝中的印楝素（azadirachtin）、葛杜宁（gedunin）等异戊二烯类和非异戊二烯类化合物也已证实具有抗疟活性。已有研究显示隐黄连碱与青蒿素联合对恶性疟原虫和伯氏疟原虫具有协同作用。本实验先验证了两种提取物的单独抗疟活性，与既往报道一致。由于加纳许多草药抗疟产品常联合使用这两种植物，科学评估其组合效应十分必要。通过CompuSyn分析，CSE和AZE组合在两种寄生虫株中均表现出CI小于1的协同作用，且DRI大于1，表明组合使用可显著减少所需剂量，从而降低潜在毒性。等bologram分析进一步证实了在多个抑制水平上的协同性。实际数据点与模拟数据点的一致性支持了结果的可靠性。
5. 结论（Conclusion）
血红白叶藤（Cryptolepis sanguinolenta）和印楝（Azadirachta indica）提取物对恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）3D7和DD2株表现出协同相互作用，这为它们在多种多草药抗疟制剂中的组合使用提供了科学依据。该结果有助于推断人体中联合用药的适当剂量，并鼓励进一步研究其组合作用机制及相关信号通路。