《Journal of Orthopaedic Translation》：Biomimetic nanodelivery of antagomiR-155-5p ameliorates wear particle-induced osteolysis by dual regulation of Gas6/Axl-mediated macrophage inflammation
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摘要
背景：无菌性松动（AL）是全关节置换术后假体失败的主要原因，其由磨损颗粒诱导的巨噬细胞活化、过量炎症因子分泌及随后的假体周围骨溶解所触发。微小RNA（miRNAs）作为该病理级联反应的关键调控因子，但具体的功能性miRNAs及其精确调控机制仍未完全阐明。
摘要
背景：无菌性松动（AL）是全关节置换术后假体失败的主要原因，其由磨损颗粒诱导的巨噬细胞活化、过量炎症因子分泌及随后的假体周围骨溶解所触发。微小RNA（miRNAs）作为该病理级联反应的关键调控因子，但具体的功能性miRNAs及其精确调控机制仍未完全阐明。
方法：研究人员在钛颗粒（TiPs）刺激的巨噬细胞中进行mRNA测序（mRNA-seq）和miRNA测序（miRNA-seq），以筛选骨溶解相关miRNAs，并在临床假体周围骨溶解组织中进行了表达验证。采用体外功能和机制实验验证miR-155-5p/Gas6/Axl调控轴，并应用小鼠颅骨骨溶解模型进行体内验证。构建了负载antagomir-155-5p的巨噬细胞膜伪装PLGA-PEI纳米颗粒（Anta-155@MNPs），并在小鼠骨溶解模型中评估其局部治疗效果。
结果：miR-155-5p在TiPs刺激的巨噬细胞和临床假体周围骨溶解组织中均显著上调。在功能上，miR-155-5p通过双重机制抑制Gas6/Axl通路，从而促进Stat1/p65磷酸化、促炎细胞因子产生和M1巨噬细胞极化：Mafb介导的Gas6转录抑制和Adam10依赖性Axl裂解抑制。在体内，该调控轴加剧了TiPs诱导的颅骨骨溶解，而局部给予Anta-155@MNPs显著减轻了骨吸收和组织炎症。
结论：miR-155-5p通过Gas6/Axl信号通路驱动TiPs诱导的假体周围骨溶解，靶向抑制miR-155-5p是预防人工关节无菌性松动的有前景的策略。
转化潜力
本研究确定了miR-155-5p/Gas6/Axl轴作为无菌性松动的新型治疗靶点，靶向性Anta-155@MNPs递送系统为临床转化治疗磨损颗粒诱导的骨溶解提供了可行的临床前策略。
**论文解读：miR-155-5p/Gas6/Axl调控轴在磨损颗粒诱导骨溶解中的作用及仿生纳米递送治疗策略**
**一、研究背景与科学问题**
全关节置换术（TJR）是终末期骨关节疾病的主流治疗手段，然而假体失败严重影响患者预后并带来沉重的经济负担。预计到2030年，美国每年将进行63.5万例全髋关节置换和128万例全膝关节置换手术，其中超过10%的患者因假体松动需要翻修手术。无菌性松动（AL）是TJR首次翻修和翻修失败的主要原因，占全髋关节翻修术的50%以上和晚期全膝关节翻修的40%以上。目前，AL的防治策略十分有限，翻修手术作为唯一治疗手段，给患者造成二次创伤并带来巨大的社会负担。因此，深入研究AL的发病机制并开发靶向治疗策略具有重要意义。
磨损颗粒诱导的炎症反应是AL的核心致病因素。假体表面脱落的磨损颗粒（如钛颗粒TiPs）主动招募巨噬细胞，触发一系列细胞反应，最终促进假体周围骨溶解。在假体周围组织中，磨损颗粒的持续存在驱动巨噬细胞发生M1极化并分泌促炎分泌组，这种失调的巨噬细胞反应进而抑制成骨、促进破骨，最终导致骨溶解和AL。因此，鉴定调控磨损颗粒诱导巨噬细胞炎症反应的核心调控因子，将为未来治疗策略的开发奠定重要基础。
研究人员通过高通量mRNA测序筛选发现，TAM（Tyro3、Axl、Mertk）受体酪氨酸激酶家族中的Gas6/Axl信号轴在颗粒应激下显著失调。经典Gas6/Axl信号作为关键的稳态调节器，调控JAK-STAT、NF-κB和PI3K-Akt等下游网络。然而，Gas6/Axl在磨损颗粒诱导骨溶解这一独特慢性微环境中的确切功能动态及其病理改变的机制尚不清楚。进一步通过miRNA测序和生物信息学靶标预测，研究人员鉴定miR-155-5p为直接靶向Gas6/Axl轴的关键上游转录后调控因子。由此提出科学问题：颗粒诱导的miR-155-5p上调如何病理性地失活或重塑免疫调节性Gas6/Axl轴以持续巨噬细胞炎症，以及该轴能否通过治疗性再平衡来阻断假体周围骨溶解。研究人员假设miR-155-5p作为上游主开关，靶向沉默该单一miRNA可全局性恢复下游Gas6/Axl介导的稳态网络。为实现骨溶解部位的精准治疗干预，需要能够在假体周围炎症微环境中导航的稳健递送系统。巨噬细胞膜包被纳米颗粒因其优异的生物相容性、固有的炎症归巢能力和隔离诱饵因子的能力而受到广泛关注。
**二、研究技术方法**
该研究综合运用了多种关键技术方法。临床样本方面，研究人员收集了中山大学孙逸仙纪念医院的无菌性松动患者和股骨头坏死患者滑膜组织。体外实验采用RAW264.7小鼠巨噬细胞系，通过mRNA-seq和miRNA-seq进行高通量转录组分析，结合生物信息学构建miRNA-mRNA共表达网络。细胞实验涉及慢病毒介导的Axl敲低、siRNA转染、agomir/antagomir转染、双荧光素酶报告基因实验、Western blot、RT-qPCR、ELISA、流式细胞术、免疫荧光和共聚焦显微镜等技术。体内实验采用小鼠颅骨骨溶解模型，通过micro-CT评估骨溶解程度。纳米颗粒制备采用双乳溶剂蒸发法构建PLGA-PEI复合物，再通过共挤出法包被巨噬细胞膜获得仿生纳米颗粒Anta-155@MNPs，并对其粒径、zeta电位、药物负载率、包封率及蛋白标志物进行表征。
**三、主要研究结果**
**3.1 TiPs促进AL患者滑膜和巨噬细胞中促炎细胞因子的产生**
利用股骨头坏死（FHN）患者滑膜作为对照，免疫组织化学染色显示AL患者假体周围滑膜中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）表达显著增加。TiPs刺激巨噬细胞后，ELISA和RT-qPCR检测证实TNF-α和IL-6的表达和释放均显著增加。组织免疫荧光染色显示AL组中Axl+/Cd68+和Gas6+/Cd68+双阳性巨噬细胞显著多于FHN组，表明Gas6/Axl信号在假体周围炎症中发挥重要作用。
**3.2 Gas6/Axl通路增强TiPs诱导的巨噬细胞炎症反应和促炎细胞因子产生**
TiPs刺激显著增加Axl转录本和蛋白表达，流式细胞术确认巨噬细胞表面Axl表达上调。Axl敲低显著降低TiPs诱导的p65和Stat1磷酸化水平，抑制p65和Stat1从细胞质向细胞核的转位。Axl敲低还降低了各时间点的促炎因子产生和转录水平。流式细胞术显示Axl敲低使iNOS+巨噬细胞百分比降低22.0%，CD206+巨噬细胞百分比增加15.3%，直接证实Axl表达与TiPs诱导的M1极化之间的关联。此外，Axl活性抑制剂R428可下调TNF-α和IL-6表达并降低p65和STAT1磷酸化。TiPs刺激也显著增加Gas6蛋白水平和条件培养基中的浓度，重组小鼠Gas6预孵育进一步增强促炎细胞因子的表达和产生。
**3.3 ADAM10在TiPs刺激的巨噬细胞中介导Axl裂解**
TiPs刺激后巨噬细胞培养上清中可溶性Axl（sAxl）浓度随时间增加。重组小鼠Axl（rmAxl）处理显著降低M1极化标志物以及Tnf和Il6的表达。TiPs刺激对pro-ADAM10二聚体表达影响不大，但显著降低成熟ADAM10水平，并诱导细胞质ADAM10向细胞膜转位。ADAM10激动剂EGCG增加上清中sAxl产生并降低膜结合型Axl表达，证实ADAM10依赖性Axl裂解的存在。
**3.4 Mafb在TiPs刺激的巨噬细胞中转录抑制Gas6产生**
JASPAR数据库分析预测Mafb为Gas6的潜在转录调控因子，并鉴定出MAF识别元件（MARE）。双荧光素酶报告基因实验证实Mafb作为Gas6的负性转录调控因子。ChIP-seq数据集再分析显示Mafb在Gas6启动子区域显著富集。TiPs刺激以时间依赖性方式下调Mafb表达。功能实验显示Mafb敲低增加Gas6表达，而Mafb过表达降低Gas6蛋白水平。
**3.5 miR-155-5p通过靶向Mafb和ADAM10调控Gas6/Axl通路及TiPs诱导的巨噬细胞炎症**
miRNA-seq结合ENCORI数据库预测和DEmiRNAs交集分析，仅miR-155-5p具有共同调控Mafb和ADAM10的潜力。RT-qPCR验证了miR-155-5p和miR-155-3p的显著上调。miR-155-5p敲低显著抑制TiPs诱导的细胞因子产生。miR-155-5p antagomir或agomir转染改变了ADAM10二聚体、ADAM10、Mafb和Gas6的表达水平。miR-155-5p敲低增加sAxl产生，该效应在GI254023X预处理的巨噬细胞中被减弱，确认miR-155-5p以ADAM10酶活性依赖方式调控sAxl产生。miR-155-5p过激活JAK-STAT和NF-κB通路，促进TiPs诱导的TNF-α和IL-6产生，但在稳定AxL抑制的巨噬细胞系中这些效应被消除。流式细胞术显示高miR-155-5p水平导致过度M1极化和减少M2极化。在RANKL和TiPs诱导的破骨细胞分化过程中，miR-155-5p抑制显著降低破骨细胞标志物组织蛋白酶K和c-Fos的表达。
**3.6 miR-155-5p在体内加重TiPs诱导的颅骨骨溶解，Axl敲低可减轻该效应**
在小鼠颅骨骨溶解模型中，shAxl慢病毒减轻TiPs诱导的骨溶解，而miR-155-5p agomir逆转这一保护效应。micro-CT显示shAxl组的BMD和BV/TV增加。免疫组化染色显示shAxl抑制TNF-α和IL-6表达，而miR-155-5p agomir抵消该抗炎效应。F4/80与iNOS共染色确认shAxl慢病毒减少M1巨噬细胞募集。骨钙素（Ocn）染色证实miR-155-5p抑制成骨细胞活性，Axl敲低部分逆转该损伤。TRAcP染色显示miR-155-5p抑制显著降低钛颗粒激活的破骨细胞活性。
**3.7 Anta-155@MNPs的制备与表征**
成功构建了巨噬细胞膜包被的PLGA-PEI纳米颗粒。TEM显示纳米颗粒由PLGA核心和细胞膜层组成，平均直径为169.3±39.4nm，zeta电位为-18.2±4.4mV。最佳N/P比为6，药物负载效率为3.52%，包封效率为85.2%。包被后纳米颗粒表达巨噬细胞标志物Axl、Il6ra和Tnfr1，具有中和促炎细胞因子的能力。RNA FISH证实纳米颗粒有效降低内源性miR-155-5p水平。CCK-8实验显示0-160nM浓度范围内无明显毒性。
**3.8 Anta-155@MNPs的体内外治疗效果评估**
体内实验显示Anta-155@MNPs比Anta-155@NPs或Anta-155单独治疗更显著地减轻TiPs诱导的颅骨骨溶解。Anta-155@MNP组BV/TV和BMD显著增加，TNF-α和IL-6产生减少，并诱导骨钙素表达。剂量-反应曲线显示EC50为2.43nmol/小鼠。局部注射后纳米颗粒在14天内保持稳定，主要分布于颅骨区域，未在其他器官检测到信号。血清ALT和BUN水平在正常范围内，主要器官无明显异常。局部注射钛颗粒增加了血清TNF-α和IL-6水平，Anta-155@MNP给药部分逆转该效应。
**四、研究讨论与结论总结**
讨论部分指出，磨损颗粒诱导的骨溶解是无菌性假体松动的主要驱动因素，巨噬细胞是最丰富的招募细胞类型，在介导炎症和骨溶解反应中发挥核心作用。本研究鉴定Axl为控制下游STAT1和NF-κB激活、巨噬细胞极化和细胞因子产生的关键调控因子。值得注意的是，关于Gas6/Axl信号通路在调节炎症中作用是促进还是抑制存在相互矛盾的报道。本研究表明在TiPs刺激的巨噬细胞中，Gas6/Axl信号通路作为促炎介质发挥作用。在TiPs诱导的炎症背景下，Axl和Gas6表达水平均升高，Axl敲低调节JAK-STAT和NF-κB信号通路。当巨噬细胞暴露于炎症刺激时，Gas6/Axl通路可介导下游炎症信号通路的激活；而当细胞外存在凋亡小体时，Gas6可结合凋亡小体上的磷脂酰丝氨酸并桥接Axl完成胞葬作用。假设钛颗粒刺激下，巨噬细胞吞噬不可降解的惰性颗粒而非凋亡细胞，Gas6无法形成生理性“PS-Gas6-Axl”桥接复合物，这种病理性吞噬可能改变了Axl激活的下游信号转导方向。在治疗策略方面，miRNAs在骨关节疾病中具有独特优势。本研究通过miRNA-seq和共表达网络分析，预测miR-155-5p与Gas6/Axl信号通路相关。巨噬细胞膜仿生纳米颗粒因巨噬细胞在AL假体微环境中广泛招募且具有吞噬活性，单独给药易被快速清除，因此该平台具有显著优势。Anta-155@MNPs直接靶向miR-155-5p这一通过Gas6/Axl通路驱动TiPs诱导炎症反应的关键分子，巨噬细胞膜包被增强了其持续疗效和靶向能力。研究局限性包括仅评估了钛颗粒的骨溶解效应、临床样本量较小以及颅骨骨溶解模型与临床关节置换环境的差异等。
研究结论：本研究发现miR-155-5p作为治疗靶点，通过Gas6/Axl信号通路促进TiPs诱导的巨噬细胞炎症和骨溶解，揭示了miR-155-5p与Gas6/Axl轴之间由Adam10和Mafb介导的内在联系。此外，研究开发的Anta-155@MNPs在减轻TiP诱导的骨溶解方面表现出优异的疗效。这些发现揭示了AL发病的新型机制，并为治疗策略的开发提供了新见解。该论文发表在《Journal of Orthopaedic Translation》。
