《Cell Proliferation》：Human iPSC-Derived Vascularised Lung Organoids for Modelling COPD and Pulmonary Hypertension
编辑推荐：
摘要翻译：能够忠实模拟人肺组织架构与疾病病理的血管化肺类器官（vascularised lung organoids, vLOs）对于推动肺部研究至关重要，但其生成仍具挑战性。在本研究中，研究人员建立了一种稳健的自组织方案，用以生成具有细胞异质性和功能性血管网
摘要翻译：能够忠实模拟人肺组织架构与疾病病理的血管化肺类器官（vascularised lung organoids, vLOs）对于推动肺部研究至关重要，但其生成仍具挑战性。在本研究中，研究人员建立了一种稳健的自组织方案，用以生成具有细胞异质性和功能性血管网络的vLOs。vLOs内工程化构建的血管呈现肺特异性特征。作为概念验证，研究人员将该平台应用于慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）和肺动脉高压（pulmonary hypertension, PH）的建模。利用患者来源的vLOs，研究人员证明香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract, CSE）可诱导近似临床COPD的病理特征，包括上皮破坏和炎症反应。此外，由PH患者生成的vLOs重现了疾病相关的血管重塑，RNA-seq揭示了内皮功能障碍中的通路失调。值得注意的是，研究人员鉴定出硫氢化钠（sodium hydrosulfide, NaHS）为潜在治疗候选药物，因其可减弱PH-vLOs中异常的内皮-间质转化（endothelial-to-mesenchymal transition, EndoMT）。总之，该研究建立了一个生理相关的vLO系统，能够模拟细胞类型特异性的疾病机制，并凸显了该平台在呼吸系统疾病机制研究与精准医学方法中的广泛适用性。
论文解读文章：
一、研究背景与问题
肺是结构高度复杂的器官，包含多种细胞类型和特化功能。人诱导多能干细胞（iPSCs）来源的三维（3D）肺类器官为研究人肺发育和病理提供了重要平台，已有气道、肺泡和肺芽类器官被用于模拟感染、囊性纤维化、特发性肺纤维化和慢性阻塞性肺疾病（COPD）等疾病。然而，传统肺类器官缺乏功能性血管网络，限制了其在肺血管疾病及伴有血管损伤的肺实质疾病研究中的应用。肺动脉高压（PH）以血管重塑、内皮细胞（EC）功能障碍和平滑肌细胞（SMC）增殖为特征；而COPD患者中30%–70%合并PH，且即使无明显PH者也存在肺血管重塑。因此，构建同时包含肺上皮和功能性血管的血管化肺类器官（vLOs），对于研究肺实质与血管相互作用的疾病机制至关重要。
二、研究内容与结论
研究人员建立了一种稳健的自组织方案，将iPSCs分化获得的气道类器官、肺泡类器官与血管类器官按2:2:1比例共培养于Matrigel/胶原I混合物中，成功生成具有细胞异质性和功能性血管网络的vLOs。通过3D免疫荧光、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和移植实验证明，vLOs内的血管具有肺特异性内皮特征，并能形成功能性灌注血管。作为概念验证，研究人员利用COPD患者来源的iPSCs生成vLOs，暴露于香烟烟雾提取物（CSE）后重现了COPD的上皮重塑、炎症反应和血管功能受损等病理特征。同时，利用携带BMPR2致病突变（c.631 C>T）的PH患者iPSCs及其等基因校正对照生成vLOs，成功模拟了PH相关的血管重塑和内皮-间质转化（EndMT），并鉴定出硫氢化钠（NaHS）作为潜在治疗药物，可抑制EndMT、改善血管重塑和纤维化。该研究发表于《Cell Proliferation》。
三、主要技术方法
本研究采用的技术方法包括：基于CRISPR/Cas9的等基因BMPR2校正iPSC系构建；多阶段定向分化获得肺祖细胞（经CPM磁珠分选）和血管类器官；三维共培养生成vLOs；肾包膜移植联合双光子活体成像检测血管灌注；scRNA-seq及生物信息学整合分析（包括来自GEO数据库的51例COPD和51例健康对照肺组织数据集）；RT-qPCR、流式细胞术、免疫荧光、Western blot、HE/Masson染色等功能与分子检测。CSE制备采用研究级香烟（3R4F）。动物实验使用免疫缺陷NOD-SCID IL2受体γ敲除（NTG）小鼠。
四、研究结果
4.1 具有肺特异性内皮细胞的血管化肺类器官（vLO）的生成与表征
通过共培养气道、肺泡和血管类器官，研究人员成功生成vLOs。3D免疫荧光显示肺类器官（EPCAM?/NKX2.1?）整合于CD31?血管网络内，血管由内皮细胞和SMA?平滑肌细胞围成管腔。scRNA-seq鉴定出肺上皮细胞、EC、SMC、成纤维细胞、巨噬细胞和干细胞等群体，其中EC表达支气管EC、gCap和aCap相关基因，间质细胞表达TBX3/TBX4/TBX5。批量RNA-seq比较发现，与肺类器官共培养的EC显著上调肺特异性EC标志物，说明肺微环境强化了器官特异性内皮身份。
4.2 vLO移植形成功能性血管灌注
将vLOs移植至免疫缺陷小鼠肾包膜下，28天后H&E染色显示移植组织中有假复层纤毛柱状上皮和含红细胞的血管。利用CD31-tdTomato标记的血管类器官，尾静脉注射伊文思蓝后双光子成像证实人血管内有效灌注。移植组织中检测到人CD31?血管、CD68?/KU80?巨噬细胞，以及基底细胞（KRT5?）、纤毛细胞（ACT?）、杯状细胞（MUC5AC?）、Club细胞（SCGB3A2?/SCGB1A1?）、AT2细胞（SPB?/SPC?）等多种上皮细胞类型。
4.3 CSE处理的vLOs重现COPD病理特征
利用具有30包年吸烟史的COPD患者iPSCs生成vLOs，经2% CSE处理2周后（CCK-8确认无显著毒性），vLOs出现促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α）显著升高；AT1（PDPN）、AT2（SPB、SPC）和杯状细胞标志物（MUC5AC）上调，而Club细胞（SCGB1A1、SCGB3A2）和纤毛细胞（FOXJ1）标志物下调；基底细胞标志物TP63下降而KRT5升高，提示鳞状化生。免疫荧光和流式细胞术证实杯状细胞增生和MUC5AC分泌增加。此外，CSE处理导致vLOs血管收缩能力显著降低。
4.4 单细胞图谱揭示CSE处理的vLOs呈现COPD样细胞和分子改变
对CSE处理和未处理的vLOs进行scRNA-seq，UMAP分析鉴定出肺上皮、EC、SMC、成纤维细胞和干细胞等群体。上皮细胞亚群包括AT2、纤毛细胞、基底细胞、杯状细胞和未定义上皮祖细胞。拟时分析显示从基底细胞/未定义祖细胞向分化谱系的连续轨迹。与51例COPD和51例健康对照肺组织scRNA-seq数据整合比较发现，COPD组AT1/AT2比例升高、基底和纤毛细胞比例降低，CSE处理的vLOs细胞比例变化与之一致。GSEA分析显示，COPD患者上皮细胞和CSE处理vLO上皮细胞共有47个一致失调通路，包括氧化磷酸化和AGE-RAGE信号通路上调；内皮细胞中两者共有24个一致失调通路，同样包含氧化磷酸化和AGE-RAGE通路上调。
4.5 NaHS和Sotatercept减轻PH患者来源vLOs中的内皮-间质转化（EndMT）
利用携带BMPR2突变（c.631 C>T）的PH患者iPSCs及其CRISPR/Cas9校正的等基因对照生成vLOs。流式细胞术显示BMPR2突变不影响EC（CD31?）和壁细胞（PDGFRβ?）的分化效率。CCK-8实验确定200 μM NaHS为最佳剂量，可促进EC增殖并抑制壁细胞增殖；10 ng/mL sotatercept（临床PH治疗药物）增加EC和壁细胞活力。PH-vLOs中EC/SMC比例异常降低，NaHS和sotatercept处理后恢复。免疫荧光显示PH-vLOs中CD31?/SMA?共定位显著增强（提示EndMT），NaHS和sotatercept可减轻这一现象。
4.6 NaHS减轻PH患者来源vLOs的血管重塑和纤维化
对PH患者和对照vLOs进行单细胞测序，鉴定出6个主要细胞群体。PH来源EC中内皮标志物PECAM1表达降低，间质标志物S100A4表达升高；GSEA显示MAPK信号通路上调。Western blot证实PH EC中CD31降低、SMA升高，NaHS处理后逆转；PH EC中S100A4和胶原IV表达升高，NaHS处理后降低。PH EC中p38 MAPK表达和磷酸化增强，Erk1/2磷酸化增强，NaHS均可抑制；NaHS还升高PH组中降低的SMAD1/5磷酸化。体内移植实验中，PH患者来源血管化肺组织肾包膜移植后小动脉中膜/外径比降低（血管重塑），腹腔注射25 μmol/kg/d NaHS 3周可显著改善，并减少胶原容积分数（纤维化减轻）。
五、讨论与结论
讨论部分指出，vLOs整合了血管网络并包含多种肺细胞类型，其内皮和间质特征提示形成肺样微环境。COPD患者来源vLOs准确重现了CSE诱导的上皮重塑，包括杯状细胞化生、Club细胞减少、鳞状化生和纤毛细胞减少，这些发现与公共scRNA-seq数据（51例COPD vs 51例对照）高度一致。GSEA揭示氧化磷酸化和AGE-RAGE信号通路在CSE处理的vLOs和临床COPD标本中均失调。BMPR2突变占遗传性PH的70%，PH-vLOs重现了BMPR2缺陷表型，包括EC/SMC比例受损和血管网络结构破坏。NaHS通过抑制EndMT、促进EC增殖、抑制壁细胞增殖，在体外和体内均改善血管重塑和纤维化。当前vLO系统局限包括缺乏功能成熟的免疫细胞区室，细胞类型比例未能完全模拟体内组织构成，以及概念验证仅基于单一患者iPSC系，未来需多供体系验证。
研究结论：该研究确立了iPSC来源的vLOs作为模拟肺部疾病的创新生理模拟平台。这些vLOs重现了COPD的复杂病理（包括上皮重塑、血管功能障碍和信号失调），模拟了PH中EndMT驱动的血管重塑机制，并实现了治疗验证（如NaHS抑制EndMT并伴随体内外血管重塑和纤维化的减轻）。vLOs代表了一种具有变革性的人源化系统，在COPD、PH及相关肺部疾病的机制发现和药物筛选中具有重要应用潜力。
