单类器官定量成像分类与追踪工作流程（SWIFT）

《Communications Biology》：A Single-organoid Workflow for quantitative Imaging classiFication and Tracking (SWIFT)

摘要

SWIFT（单类器官定量成像分类与追踪工作流程）是一种快速、模块化的流程，用于从明场图像中进行定量、时间分辨的类器官分析。仅需最少量的训练标注，SWIFT将YOLOv8、SAM与应用特异性对象分类相结合，以实现准确的单类器官分割、表型分析和追踪。该流程在类器官类型和显微镜系统中均表现出稳健性。当应用于肠道类器官时，SWIFT揭示了Wnt依赖的动态形态学转变，从而能够对上皮可塑性进行可扩展的高通量研究。

**研究背景与问题**

类器官已成为生物学、病理生理学和医学中不可或缺的模型，可在体外再现干细胞巢、谱系分化和特定器官功能等关键特征，但因其高度异质性和动态行为而难以进行定量分析。肠道类器官是最早建立且不断优化的体外体系，可忠实再现肠道稳态、损伤再生等过程，并受Wnt等信号通路的精细调控，呈现多种与体内细胞状态对应的表型转变。然而，定量分析这种体外肠道可塑性仍是当前的技术瓶颈。明场成像能以无创方式在时空维度上连续监测类器官，但现有基于深度学习的分析流程通常需要数万张人工标注图像才能训练，多为包围框水平的目标检测，难以实现精确分割和表型分类；且多数模型仅适用于单一类型类器官，聚焦静态检测，无法追踪表型随时间的变化。因此，开发一种快速、通用、可扩展且能对类器官进行时空动态追踪的分析流程成为迫切需要。

**研究内容与意义**

为解决上述局限，研究人员开发了SWIFT——一种用于类器官图像自动化时间分辨分析的稳健、模块化流程。SWIFT整合YOLOv8目标检测模型、SAM分割模型及QuPath中的随机树分类器，将检测、分割、分类和追踪串联为一体化流程，仅需极少量微调标注即可运行。研究人员将该流程应用于小鼠结肠类器官，定量揭示了Wnt剂量依赖的形态学转变，证明其能够规模化支持上皮可塑性等生物学问题的高通量研究。该论文发表在《Communications Biology》。

**关键技术与方法**

样本队列来源包括研究人员自行建立的小鼠结肠类器官（取自8周龄雌性C57BL/6J野生型小鼠，经瑞士沃州兽医当局许可，许可证号VD 3497）以及两个公开明场类器官数据集（OrgaSegment和OrganoID，涵盖人结肠、人PDAC、人肺、小鼠小肠和人直肠类器官）。主要技术方法包括：基于Nikon Ti2倒置显微镜的10×明场多拼图延时成像，并采用扩展景深投影生成全聚焦图像；在QuPath中由两名独立标注者对417张图像中的类器官进行包围框人工标注，微调YOLOv8s检测模型；使用Segment Anything Model对检测框内物体进行精确轮廓分割；利用QuPath的随机树分类器对囊状、柱状、出芽、死亡四种形态学表型进行分类；在R中采用质心最近邻一对一匹配策略进行跨天单类器官追踪；并通过qPCR和Cleaved Caspase-3免疫组化进行独立分子学验证。

**研究结果**

*基于明场图像的深度学习单类器官检测-分割算法的开发与基准测试*

研究人员将YOLOv8s在包含417个标注实例的16张小鼠结肠类器官明场图像上微调，获得模型A，其验证集精度为0.674、召回率为0.832、mAP50为0.762。在独立数据集上，模型A的召回率达到0.92，F1.50为0.79。加入质量控制步骤排除图像边缘不完整类器官后，检测保真度进一步提高。该流程在不同操作经验的使用者之间表现出良好稳健性。在不额外微调的情况下，模型A在人胰腺导管腺癌和人肺类器官公开数据集上保持较强性能；对于形态更复杂的小鼠小肠和人直肠类器官，仅需18个或153个额外标注对象进行微调即可快速恢复高精度与高召回率，表明该流程对类器官类型和显微镜系统具有良好的通用性。与各公开数据集原始方法相比，SWIFT性能相当或更优，尤其在分割效率方面提升明显。

*单类器官对象的时空解析用于类器官培养中表型动态的定量分析*

为训练应用特异性分类器，研究人员基于组织学特征、形态学参数和分子标记定义了囊状、柱状、出芽、死亡四种典型肠道类器官形态，并利用面积、圆形度、平均强度、强度标准差等参数在QuPath中构建随机树分类器。该分类器对小鼠肠道类器官的召回率大于0.94，F1分数大于0.95；被截断的类器官被归入“忽略”类以排除分析。研究人员进一步实现基于质心最近邻的追踪算法，以150μm位移阈限逐帧连接同一类器官，构建跨多天的谱系轨迹，同步记录形态学特征和表型转变过程（如囊状→出芽），为群体水平统计分析提供了动态的单类器官层面补充。

*活体类器官追踪揭示再生与稳态上皮状态之间的Wnt依赖性转变*

研究人员用含不同浓度Next-Generation Surrogate Wnt（Wnt-NGS）和R-spondin1的五种培养基（A–E）培养小鼠结肠类器官。高Wnt条件下（Medium A，WENR），类器官保持大而囊状的“再生样”上皮状态，增殖旺盛但培养5天后发生广泛死亡；在配方中补充FGF2、IGF1、NRG1并逐步降低Wnt/R-spondin1后（Medium B–E），细胞死亡减少，柱状和出芽等分化表型富集，呈现“稳态样”上皮特征；Wnt降至阈值以下时，类器官的生长和存活均严重受损。虽然群体平均面积在Medium B和D间无显著差异，但单类器官追踪显示生长速率与Wnt浓度呈正相关，且快速扩张的类器官更易早期崩溃。Sankey图分析表明，高Wnt条件下多数类器官在第5天转入死亡状态，而降低Wnt促进囊状向柱状或出芽的转变。这些形态学结论得到qPCR和Cleaved Caspase-3免疫组化等独立分子验证的支持，说明形态学可作为快速且信息丰富的生物学机制替代指标。

**总结讨论与结论**

SWIFT通过整合YOLOv8s、SAM和QuPath中的下游分类与追踪模块，克服了现有深度学习方法需要大量训练数据、依赖专家干预和聚焦静态检测的关键局限。其模块化设计使检测、分割、分类和追踪可灵活组合，并且能以极少额外标注快速适应新的类器官类型和成像系统，为类器官行为的时间分辨定量监测提供了快速、稳健、准确的工具，尤其适用于中高通量应用如疾病模型类器官的药物筛选。研究结论翻译如下：总而言之，SWIFT为时间分辨的类器官表型定量提供了一种快速、稳健、准确且模块化的解决方案。通过整合YOLOv8s、SAM以及下游分类与追踪模块，它克服了需要大量训练和专家干预的现有深度学习方法的关键局限。SWIFT能够实现对类器官行为和表型转变的定量、动态监测。其适应性使其特别适用于中高通量应用，包括对疾病建模类器官（如囊性纤维化）的药物筛选。