《Pesticide Biochemistry and Physiology》：Glucose-driven metabolic reprogramming enhances fengycin biosynthesis and antifungal activity in
Bacillus amyloliquefaciens FH1-RS1 against
Verticillium dahliae V991
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由土传真菌病原大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起的棉花黄萎病造成全球性毁灭损失，而芽孢杆菌介导拮抗作用的胞外代谢物因菌株而异。尽管对解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）FH1-RS1的基因组分析揭示了多
由土传真菌病原大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起的棉花黄萎病造成全球性毁灭损失，而芽孢杆菌介导拮抗作用的胞外代谢物因菌株而异。尽管对解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）FH1-RS1的基因组分析揭示了多样的抗菌生物合成潜力，但其抗大丽轮枝菌V991的主要胞外代谢物尚未明确。研究人员通过系统培养基筛选与葡萄糖滴定，确定含2%（w/v）D-葡萄糖的LB培养基（LB20）为支持最大抗真菌活性的条件，该活性在48 h达到峰值。LB20相对于LB的转录组分析显示，非核糖体肽合成酶（NRPS）机械、脂肪酸生物合成、氧化磷酸化、三羧酸循环及前体供应通路协同上调。生物活性导向分离与定量化学分析表明，芬荠素（fengycin）、伊图林（iturin）和表面活性素（surfactin）产量分别增加36.2、7.5和3.8倍，达962.5、75.19和237.89 mg L?1，其中芬荠素相对增幅最显著。组分水平生物测定将芬荠素富集组分确定为该条件下抗真菌活性的主导来源。超高效液相色谱-高分辨串联质谱（UHPLC-HRMS/MS）进一步支持一系列芬荠素A同系物与同量异序芬荠素B对应物及低丰度芬荠素相关变体，最强抑制关联于较晚洗脱、含较长链同系物的芬荠素富集组分。综上，这些发现将明确的葡萄糖补料培养条件与高芬荠素生产状态联系起来，为优化FH1-RS1来源抗真菌代谢物生产以用于生物防治应用提供依据。
研究背景与立项依据：大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起棉花黄萎病，其黑素化微菌核可在土壤存活十余年，常规防控手段受限。利用芽孢杆菌（Bacillus spp.）等根际有益微生物进行生物防治具备孢子抗逆、定殖力强及产抗菌代谢物等优势，但不同菌株拮抗大丽轮枝菌的主导分子机制各异，FH1-RS1虽在体外对V991有抑制力，其具体胞外抗真菌物质长期未定义。研究人员因此围绕“培养条件—转录重编程—产物鉴定”主线，锁定葡萄糖作为可控变量，旨在明确LB20条件下FH1-RS1高产何种脂肽并阐释代谢基础，服务于稳定生防制剂开发。论文发表于《Pesticide Biochemistry and Physiology》。
主要技术方法概览：研究人员以解淀粉芽孢杆菌FH1-RS1为对象，采用PacBio+Illumina全基因组测序与antiSMASH预测次级代谢基因簇；设置PDB、LB、LB20等多培养基及0.1%–10%葡萄糖梯度、24–120 h时序收获胞外无细胞上清（CFS）；以V991为靶标用纸碟扩散法测真菌抑制率（FIR）；取48 h LB与LB20细胞做链特异RNA-seq（DESeq2筛差基，阈值adj. P<0.001、|log?FC|>1）并匹配胞外非靶向LC-MS/MS；CFS经HCl酸化沉淀脂肽后甲醇洗脱得脂肽材料（LPM），反相HPLC分段，制备型RP-HPLC分芬荠素/伊图林/表面活性素三族及LP1–LP20亚份；UHPLC-HRMS/MS（TripleTOF 6600）定性并借标准曲线定量芬荠素。
研究结果
3.1 基因组定位揭示FH1-RS1潜伏抗菌库：全基因组3,929,190 bp、GC 46.5%、4184个CDS，GO/KEGG/COG注释覆盖代谢与次生代谢，筛查到NRPS、铁载体、水解酶、定殖相关位点，为转录分析奠基。
3.2 不同培养基下FH1-RS1胞外代谢物抗真菌活性：六培养基比较中LB20的FIR达61.29%±3.87%，较LB（9.66%）升6.34倍；PDB约2%糖有效但PDB50不增；LB内葡萄糖滴定呈钟形，2.0%–2.5%峰值（~61%），>2.5%回落，选定LB20作后续条件。
3.3 LB20培养48 h抗真菌代谢物积累达峰：时序显示LB20在48 h FIR 58.92%±5.47%（较24 h3.9倍、较LB同期6.4倍），72 h后衰减；LB20活菌数24 h达峰、pH先降后回中性，LB缓长且渐碱化，明确48 h LB20为取样点。
3.4 LB20与LB差异基因表达：RNA-seq获1602个显著差异基因（721上/881下）。KEGG富集上调端为氧化磷酸化、鞭毛组装、非核糖体肽（NRP）合成；fenA–fenE均上调约155倍，ituA–C平均931倍，srfAA–AC约194倍。呼吸链ndh升48倍、sdhA/B 142–288倍、qoxB–D 333–942倍，ATP合酶atpC 201倍；TCA之lpd 934倍、aceF 622倍；PP途径zwf 47.8倍、gnd 49.2倍；鞭毛fliC/fliD~130倍、motA/B>100倍。结论：葡萄糖驱动中心碳流、呼吸产能、脂肽前体（脂肪酸acc/fab升达746倍）与分泌协同重编程，芬荠素操纵向高而稳。
3.5 脂肽提取分级与活性归属：酸化沉淀得LP?（LB20 2.548 g L?1 vs LB 1.179 g L?1），甲醇溶出LPM。脱脂上清（LFS）活性近失，LPM恢复抑制；制备RP-HPLC按留时分F1伊图林、F2芬荠素、F3表面活性素，等剂量24 μL纸碟测验中F2（芬荠素富集）抑菌圈最大，F1/F3较弱，确证芬荠素为主导抗真菌因子。
3.6 反相HPLC与芬荠素同系物解析：C18柱0.84 mL min?1、210 nm、TFA体系梯度，LB20-LPM在芬荠素窗（7–12 min）主峰突出；UHPLC-HRMS/MS正离子模式指认芬荠素A系列、同量异序芬荠素B及低丰变体，较晚洗脱长链同系物关联最强抑制；标准曲线y=96004x?3418.3（R2=0.9983）估得LB20芬荠素962.5 mg L?1，伊图林75.19、表面活性素237.89 mg L?1，芬荠素倍数跃升36.2倍。
讨论与结论翻译：研究人员讨论指出，FH1-RS1在LB20+48 h状态下通过葡萄糖感应启动呼吸与TCA/PPP扩容，为NRPS提供ATP、NADPH及脂肪酸尾；芬荠素（而非伊图林或表面活性素）在该菌株–大丽轮枝菌配对中是首要胞外抗真菌效应分子，表面活性素更多关联定殖、伊图林虽转录峰值极高但胞外累积与抑菌贡献次位。结论部分表明：明确补加2% D-葡萄糖的LB、发酵48 h构成可重复的高芬荠素生产窗口；转录重编程与生物活性导向分离共同将芬荠素锚定为FH1-RS1抗V991 V991的核心脂肽；该条件化为生防菌剂工艺放大与田间黄萎病治理提供代谢层面依据。
