泛癌剪接图谱揭示SLK的可变剪接调控癌症转移

《Pharmacological Research》：Pan-cancer splicing landscape identifies that the alternative splicing of SLK regulates cancer metastasis

　　

摘要
剪接失调频繁发生于癌症中，然而大多数错误剪接基因的功能意义仍不清楚。通过全面的泛癌剪接失调分析，研究人员识别出癌症中普遍错误剪接的基因，并惊讶地发现它们在细胞迁移中具有显著的功能富集。有趣的是，编码支架蛋白的STE20样蛋白激酶（SLK）基因在多种癌症类型中表现出从SLK-S到SLK-L异构体的显著剪接转换。详细研究表明，这种剪接转换在细胞和动物模型中促进了癌症转移。机制上，RNA结合蛋白Fox-1同源物2（RBFOX2）被鉴定为调控SLK剪接的剪接因子。两种异构体以不同亲和力与occludin相互作用，从而贡献于它们在癌症转移中的独特活性。值得注意的是，设计用于抑制SLK-L剪接的反义寡核苷酸有效抑制了癌症迁移和侵袭。综上，本研究揭示了一个在控制癌症转移中发挥关键作用的新的剪接开关，为通过剪接操控进行癌症治疗提供了新思路。

**论文解读：泛癌剪接图谱揭示SLK可变剪接调控癌症转移的机制与治疗潜力**

**一、研究背景与科学问题**

前体信使RNA（pre-mRNA）的可变剪接（alternative splicing, AS）是基因表达转录后调控的关键步骤，能够从单个基因产生不同的剪接异构体，从而在RNA水平扩展蛋白质组的多样性。剪接失调与包括癌症在内的多种人类疾病密切相关。尽管广泛的剪接改变被视为癌症的一个标志性特征，但由于癌症异质性带来的复杂机制和大量噪声，剪接失调的研究面临挑战。另一方面，剪接失调在不同癌症类型中常常具有共同效应，因此系统性地研究癌症相关剪接的普遍调控机制，将为理解癌症发展提供关键见解。

研究人员此前已在不同肿瘤中进行过转录组-wide的癌症相关剪接事件鉴定，并进一步将分析扩展到癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）中所有具有足够配对正常样本的常见癌症类型。有趣的是，在超过10种癌症类型中发生剪接改变的基因，功能富集于肌动蛋白丝组织、细胞连接组装和细胞-基质黏附等癌症相关迁移过程，且其中许多基因编码具有相似结构的支架蛋白。在这些公共的癌症相关剪接事件中，STE20样蛋白激酶（STE20-like protein kinase, SLK）基因第13外显子的选择性包含被发现是癌症中最常见的错误剪接事件之一，在12种癌症类型的数千名癌症患者中表现出显著的剪接改变。然而，这种全局性剪接转换的功能后果尚不清楚。

SLK是一种属于生发中心激酶家族的丝氨酸/苏氨酸激酶，包含N端激酶结构域、预测的中心无序区域和称为ATH（ATP依赖性RNA解旋酶）结构域的C端卷曲螺旋结构域。SLK敲除动物被报道为胚胎致死，表明其在细胞中的重要作用。SLK是细胞骨架的关键调控因子，可激活Rho家族GTP酶，进而调节细胞骨架动力学和细胞迁移。尽管SLK的细胞功能被认为主要通过其激酶活性介导，但近期研究报道SLK的某些功能似乎不依赖于激酶活性，提示SLK也可能作为信号转导通路的重要支架蛋白。越来越多的证据表明SLK在癌症发展中发挥重要作用，但其剪接改变的功能意义仍不清楚。因此，揭示SLK剪接改变的功能和机制，将为理解这些普遍失调的关键剪接事件提供代表性见解，并具有治疗潜力和临床价值。

**二、研究内容与主要结论**

本研究发表于《Pharmacological Research》。研究人员首先评估了两种SLK异构体的生物学功能，发现它们在控制癌细胞进展中具有不同功能。他们进一步探索了SLK错误剪接促进癌症发展的机制，并试图寻找操控SLK剪接以造福癌症治疗的策略。最后，研究人员使用反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides, ASOs）抑制SLK第13外显子的包含，从而抑制癌症迁移和侵袭。该研究揭示了癌症中最常错误剪接基因之一的生物学后果和潜在机制，并强调了其在癌症诊断和治疗中的潜在应用价值。

**三、关键技术方法**

该研究使用了多种关键技术方法。基于TCGA数据库的配对正常样本进行泛癌分析，利用已发表的IDEAS数据库计算百分比剪接包含（percent-splice-in, PSI）值；采用小干扰RNA（siRNA）和CRISPR-Cas9基因编辑技术构建异构体特异性敲低和稳定表达细胞系；利用转录组测序（RNA-seq）及基因本体（Gene Ontology, GO）和基因集富集分析（GSEA）；通过eCLIP-seq数据集分析RNA结合蛋白（RBP）结合位点；采用RNA免疫沉淀（RIP）、RNA pull-down、co-IP和表面等离子体共振（SPR）检测蛋白-RNA及蛋白-蛋白相互作用；使用AlphaFold/Parafold进行蛋白结构预测；建立异种移植小鼠模型和尾静脉转移模型，并运用生物发光成像进行评估。细胞系来源包括HCT116、PC9、HEK293T等，动物实验使用BALB/c裸鼠和C-NKG小鼠。

**四、研究结果**

**4.1 支架蛋白SLK在常见癌症类型中经历广泛的剪接改变**

基于先前建立的方法，研究人员通过比较TCGA中肿瘤样本与配对正常对照进行了全球AS失调的泛癌分析。在TCGA总共34种癌症类型中，仅14种满足至少20对配对正常样本的标准。进一步分析显示，约70%的剪接事件在至少两种癌症类型中显著改变，表明剪接失调在癌症类型间具有共同特征。在超过10种癌症类型中剪接改变的基因功能富集于细胞迁移过程。AlphaFold 3.0结构预测显示MPRIP、MTSS1、ENAH和SLK等几个基因的蛋白产物具有结构相似性，均包含一个长的稳定结构化区域和一个灵活的内在无序区域。

SLK的剪接在12种不同癌症类型中发生显著改变，其中9种癌症类型的PSI值显著增加，表明剪接向长异构体（SLK-L）转换。在肺癌、乳腺癌和结肠癌这三种全球最常见的癌症中，所有正常对照上皮细胞系均表达短异构体（SLK-S），而许多癌症细胞系中剪接向SLK-L转换。SLK-L的表达水平似乎与细胞系的侵袭性相关。人SLK基因位于10号染色体，包含19个外显子。第13外显子的选择性包含产生L和S两种异构体，它们在C端卷曲螺旋结构域中相差31个氨基酸。AlphaFold结构预测提示外显子13位于卷曲螺旋结构域内长α-螺旋的末端，暗示SLK-L和SLK-S之间存在不依赖激酶活性的功能差异。SLK外显子13的剪接在哺乳动物中高度保守。GTEx数据显示SLK-S在自我更新缓慢的组织（如脑）中优先表达，而SLK-L在快速增殖和自我更新的组织（如皮肤）中优先表达，与肿瘤中主要为活跃分裂细胞的剪接变化模式一致。

**4.2 SLK的可变剪接影响癌细胞增殖和迁移**

研究人员使用特异性靶向SLK-L（识别第13外显子）或SLK-S（结合第12和14外显子的剪接连接处）的siRNA，在HCT116和PC9两种高侵袭性癌细胞系中进行研究。结果显示SLK-L敲低（siL）细胞的增殖、贴壁依赖性集落形成、迁移和侵袭显著减少，而SLK-S敲低（siS）细胞与对照表型相似，表明两种异构体具有不同的细胞功能，SLK-L在促进癌细胞增殖和迁移中发挥关键作用。

为克服siRNA瞬时敲低和脱靶效应的局限性，研究人员利用CRISPR技术建立了特异性表达SLK-L或SLK-S的HCT116稳定细胞系。与异构体特异性敲低结果一致，仅表达SLK-S的HCT116细胞在增殖、集落形成、迁移和侵袭方面显著减少，而稳定表达SLK-L的细胞与野生型细胞生长相似，甚至表现出增强的迁移和侵袭能力。

**4.3 SLK-L像癌基因一样恢复癌症的攻击性**

为进一步阐明向SLK-L的剪接转换是否导致癌细胞攻击性，研究人员建立了SLK敲除（SLK-KO）HCT116细胞系，并通过慢病毒单独或组合重新引入两种异构体。结果显示，SLK-S重新表达的表型与稳定SLK-S细胞相似，表现出较低的侵袭性。相反，SLK-L表达恢复了细胞增殖、集落形成和迁移至野生型水平，甚至侵袭性超过SLK-WT细胞。两种异构体共表达的表型与单独SLK-L表达或野生型对照相似，表明SLK-L在癌症进展中发挥主导作用。值得注意的是，SLK-KO细胞在集落形成和侵袭实验中比SLK-S重新表达细胞更具侵袭性，暗示SLK-S可能在维持细胞稳态而非促进致癌转化中发挥作用。

**4.4 SLK剪接转换在动物模型中对癌症转移有显著影响，对癌症生长影响较小**

研究人员使用异种移植小鼠模型评估异常SLK剪接对肿瘤进展的影响。将SLK-WT、SLK-L、SLK-S和SLK-KO细胞皮下注射到BALB/c裸鼠中，在两个独立实验中，四组间的肿瘤大小无统计学显著差异。但终点肿瘤重量检查显示SLK-S组的皮下肿瘤比SLK-WT、SLK-L和SLK-KO组更轻。在肿瘤生长方面，SLK-L促进癌症生长，而向SLK-S的剪接转换可能抑制癌症增殖但影响温和。

考虑到癌症转移是癌症相关死亡的主要原因，研究人员使用尾静脉注射实验检测不同SLK细胞群的转移定植和后续生长。在C-NKG小鼠中，SLK-L组表现出更快的转移和更高的癌症负荷，而SLK-S组在注射后十二天无可检测肿瘤，SLK-WT组有少量转移。SLK-L组小鼠的生存率远低于SLK-WT和SLK-S组。在BALB/c裸鼠模型中也获得了支持性结果。动物实验提供了清晰证据表明SLK的AS对癌症转移具有重要功能影响，提示SLK的剪接转换可能是预防或抑制癌症转移的有前景的治疗靶点。

**4.5 SLK剪接转换影响细胞迁移通路中的许多基因**

研究人员对CRISPR生成的具有不同SLK异构体水平的稳定细胞系进行了RNA-seq分析。结果显示SLK-L和SLK-WT的转录组具有较高相似性，而SLK-S和SLK-KO形成独立聚类。完全剪接转换（SLK-L对SLK-S）诱导的差异表达基因（DEGs）显著富集于Wnt信号通路、细胞黏附和间充质发育等癌症转移相关通路，而SLK-KO对SLK-WT的DEGs与细胞分裂和DNA复制密切相关。GSEA分析鉴定出两组差异表达的EMT相关基因。这些结果表明SLK剪接转换在控制癌症迁移中发挥关键作用，而SLK敲除影响不同的细胞功能，解释了为何SLK敲除对癌症发展影响不大。

**4.6 SLK异构体与紧密连接标记物occludin以不同亲和力相互作用**

研究人员首先验证了两种异构体在癌细胞中均保留激酶活性，表明它们在癌症迁移中的功能差异依赖于蛋白结合结构域。两种异构体均定位于细胞膜附近，排除了亚细胞定位差异的可能性。在EMT标志物检测中发现，SLK-S细胞中occludin表达水平显著高于SLK-WT和SLK-L细胞，而SLK-KO细胞表达的occludin少于其他组。免疫荧光显示SLK和occludin在细胞膜周围共定位。co-IP实验证实两种SLK异构体与外源性occludin差异性地相互作用，SLK-S的结合强于SLK-L。截短实验表明SLK的卷曲螺旋结构域足以结合occludin，而缺乏该结构域的构建体完全丧失结合活性。SPR实验提供了直接证据，两种SLK异构体均与occludin直接结合，但SLK-S的亲和力（KD=3.55×10?11 M）强于SLK-L（KD=1.22×10?1? M）。

**4.7 RBFOX2被鉴定为SLK可变剪接的调控因子之一**

研究人员收集ENCODE中所有RBP的eCLIP-seq数据集，鉴定出三种潜在结合SLK pre-mRNA的剪接因子。通过敲低和过表达验证，确认RBFOX2确实调控SLK的AS。RBFOX2敲低促进SLK第13外显子包含，而过表达RBFOX2显著抑制外显子13包含。RIP实验证实RBFOX2与SLK pre-mRNA结合。研究人员在SLK的12号内含子中鉴定出两个RBFOX2共有结合基序（UGCAUG），并通过RNA pull-down实验进一步确认了结合。SLK剪接minigene报告基因实验表明RBFOX2通过结合12号内含子中的UGCAUG基序调控SLK的AS，促进第13外显子跳跃，使剪接从SLK-L向SLK-S转换。TCGA数据显示RBFOX2表达在大多数癌症中下降，尤其是在SLK剪接转换为长异构体的癌症类型中，进一步表明了RBFOX2下调与SLK剪接之间的相关性。

**4.8 靶向SLK剪接的反义寡核苷酸影响癌症进展**

研究人员设计了几种与SLK第13外显子剪接位点附近配对的ASOs，测试其抑制外显子13包含的活性。其中ASO6和ASO8表现出最显著的剪接抑制作用，将剪接从SLK-L转换为SLK-S。用ASO6和ASO8处理细胞后，癌细胞的增殖、迁移和侵袭均减少，且对迁移和侵袭的抑制作用更为显著。在尾静脉转移C-NKG小鼠模型中，ASO6和ASO8治疗从第3周开始显著抑制肿瘤转移。H&E和Ki-67免疫组织化学染色显示，两种ASO处理均降低了肺和肝中存活肿瘤细胞密度。

**五、讨论与结论**

本研究发现SLK作为一种具有长卷曲螺旋结构域的支架蛋白，在多种癌症类型中经历显著且广泛的剪接转换，参与细胞迁移相关网络。SLK的剪接转换在控制癌症转移中发挥关键作用，可能是癌症治疗的潜在靶点。与以往研究主要关注SLK催化活性不同，本研究揭示SLK的剪接转换不改变其激酶活性，而是改变支架蛋白的对接区域，重新连接其结合伙伴或改变结合数量。具体来说，SLK-L通过与SLK-S竞争相同的下游伙伴（如细胞骨架组分）来抑制SLK-S的功能。

关于RBFOX2调控SLK剪接的复杂性，尽管RBFOX2被确认为真正的SLK剪接调控因子，但其表达并不能完全解释跨癌症类型的SLK剪接变化，表明多种RNA结合蛋白汇聚于该选择性外显子。QKI和HNRNPA1的调控作用尚待测试。破坏RBFOX2结合基序的双突变体仍对RBFOX2敲低有响应，提示存在额外的结合位点或间接调控层。

在治疗应用方面，ASOs靶向SLK剪接可调控癌症细胞进展，代表剪接调控领域的显著进展，具有临床转化前景。研究人员发现靶向5‘剪接位点的ASOs优于靶向3’剪接位点的ASOs，推测有效ASOs可能阻断了U1 snRNP的结合。

结论部分：支架蛋白SLK的剪接在多种癌症中表现出向长异构体的特定转换。SLK基因的不同异构体具有不同的生物学功能。SLK-L异构体对癌症发展至关重要，特别是在促进癌症转移方面，而向SLK-S的剪接转换可以减弱癌症进展。研究还表明，SLK-L可能通过破坏SLK-S与occludin的相互作用、使紧密连接不稳定、导致异常细胞命运而发挥致癌蛋白的功能。这为SLK剪接平衡的破坏如何参与癌症转移的发生和进展提供了重要见解。此外，通过ASO靶向SLK剪接的策略为治疗干预提供了有前景的方向。该研究揭示了SLK作为癌症中最常错误剪接基因之一的生物学后果和潜在机制，并证明其可变剪接在癌症发展中发挥关键作用，凸显了其在癌症诊断和治疗中的潜在重要意义。