芹菜素通过结合PRDX2调控Trx1保护高血压性脑出血

《Phytotherapy Research》：Apigenin Protects Hypertensive Intracerebral Hemorrhage by Regulating Trx1 Through Binding to PRDX2

　　

脑出血（intracerebral hemorrhage, ICH）仍是最严重的卒中亚型，具有高死亡率和致残率。尽管芹菜素（apigenin）在临床前研究中显示出脑保护潜力，但其作用机制，尤其在高血压性ICH中的机制仍知之甚少。研究人员探究了芹菜素对抗高血压性ICH的分子通路。研究人员采用不同剂量芹菜素处理的高血压性ICH小鼠模型，通过转录组学分析、分子对接、表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）和pull-down实验，鉴定过氧化还原蛋白2（peroxiredoxin 2, PRDX2）为芹菜素的直接靶点。利用Prdx2?/?小鼠和重组人硫氧还蛋白1（recombinant human thioredoxin 1, rhTrx1）救援实验验证信号通路。通过组织学分析、western blot、免疫荧光和zymography评估出血、氧化应激、炎症和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重塑。芹菜素给药显著降低ICH发生率、出血体积和面积，同时增强血管完整性，且独立于血压变化。研究人员鉴定PRDX2为芹菜素的直接结合伙伴，其相互作用稳定PRDX2表达。PRDX2缺失取消芹菜素的保护作用并加剧氧化应激、神经炎症和血管损伤。此外，芹菜素通过PRDX2上调Trx1表达，rhTrx1给药通过在Prdx2?/?小鼠中减少氧化损伤、炎性细胞浸润和血管平滑肌细胞凋亡拯救保护表型。该研究阐明了一种新颖的芹菜素-PRDX2-Trx1抗氧化信号通路，通过血压非依赖机制保护高血压性ICH。这些发现不仅为开发基于芹菜素的脑血管疾病治疗提供机制基础，也为未来临床转化提供新策略和切入点。

研究背景：脑出血（intracerebral hemorrhage, ICH）约占所有卒中病例的10%–15%，一个月死亡率接近40%，现有治疗以血肿清除、血压管理和支持治疗为主，长期神经功能改善有限。氧化应激与神经炎症被认为是继发性脑损伤的核心驱动因素，而血管完整性维持与内皮功能保全在出血前即具决定意义。芹菜素（apigenin）作为天然黄酮类化合物，已在动脉粥样硬化与缺血性卒中模型中表现出抗炎、抗氧化及改善内皮功能的潜力，但其在高血压性ICH中对血管完整性的具体作用与分子机制尚未阐明。本研究发表于《Phytotherapy Research》，旨在明确芹菜素是否经特定靶点在血压非依赖条件下减轻高血压性ICH损伤，并为天然来源脑血管保护剂提供转化依据。

主要技术方法：研究人员使用8月龄雄性C57BL/6N野生型（wild-type, WT）与CRISPR/Cas9构建的Prdx2^?/?小鼠，以血管紧张素II（angiotensin II, Ang II）联合Nω-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐（Nω-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride, L-NAME）诱导自发性高血压ICH模型，干预组提前两周灌胃低、中、高剂量芹菜素（10、50、150 mg/kg/day）。核心方法包括：转录组测序（RNA-seq）与Connectivity Map（CMap）预测、生物素标记芹菜素亲和pull-down联合液相色谱串联质谱（LC–MS/MS）靶蛋白筛选、分子对接与SPR测定结合亲和力、细胞热位移实验（cellular thermal shift assay, CETSA）验证蛋白稳定性、免疫荧光与TUNEL/DHE染色评估氧化与凋亡、明胶zymography检测基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）活性、Western blot检测PRDX2/Trx1及AKT/ERK磷酸化、MRI（T2^*）与血红蛋白定量评估出血、并对Prdx2^?/?小鼠行侧脑室注射rhTrx1救援。

研究结果：

3.1 芹菜素在高血压性脑出血中的血压非依赖保护：研究人员通过CMap/DrugPattern预测芹菜素关联高血压与脑血管意外指征，在Ang II+L-NAME模型中证实高剂量芹菜素（150 mg/kg/day）剂量依赖性地降低ICH发生率（模型组约85%，高剂量组显著下降）、减少MRI与组织学出血体积/面积，增加脑小动脉壁厚度，但各组收缩压无差异，表明保护不依赖降压。

3.2 芹菜素改变ICH模型脑血管转录组：对脑隔离血管行RNA-seq，Ang II组 vs 芹菜素组鉴定1493个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）；KEGG富集于细胞因子-受体、TNF、趋化因子通路，GSEA显示氧化应激应答与抗炎应答增强，提示机制涉及 redox稳态与炎症抑制。

3.3 芹菜素与PRDX2相互作用并调控其水平：生物素-芹菜素pull-down后LC–MS/MS锁定PRDX2为特异性结合候选；AutoDock Vina对接得分?6.5 kcal/mol，氢键涉及Met-1、Ala-2、Gly-116、Asp-145；SPR得K_d=34.4 μM；CETSA显示芹菜素提升PRDX2热稳定性；pull-down与Western blot证实芹菜素逆转ICH模型中脑血管PRDX2下调。

3.4 PRDX2缺失加剧高血压ICH并抵消芹菜素保护：Prdx2^?/?小鼠ICH发生率与出血负荷显著升高，芹菜素不再降低发生率/出血量，且不改变血压；免疫荧光显示CD31⁺血管密度与α-SMA⁺小动脉壁厚度在缺失组中降低，芹菜素增益被取消，证明PRDX2为必需介质。

3.5 芹菜素抑制氧化应激与炎症由PRDX2介导：DHE染色示芹菜素减少活性氧（reactive oxygen species, ROS）⁺细胞，Prdx2^?/?逆转该效应；zymography示MMP-9活性被芹菜素抑制、缺失组回升；Ly6G⁺中性粒细胞与Iba1⁺小胶质细胞浸润在缺失组增加；胶原IV（collagen IV, Col IV）基底膜覆盖在芹菜素组增加、缺失组消失；TUNEL⁺血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）凋亡减少被缺失逆转；Western blot示PRDX2缺失致AKT/ERK磷酸化增强且不被芹菜素抑制。

3.6 PRDX2经Trx1轴介导保护：芹菜素在WT上调Trx1，Prdx2^?/?基础Trx1降低且上调消失；向Prdx2^?/?侧脑室注射rhTrx1显著降低ICH发生率、出血体积、DHE⁺细胞数、炎性浸润，恢复Col IV覆盖与VSMC存活，且不影响血压，表明Trx1可部分补偿PRDX2缺失的氧化还原缺陷。

讨论与结论翻译：芹菜素作为天然黄酮在心脑血管保护中多有益处，既往有降压报道，但本模型内其保护不伴血压变化，差异或源于剂量、给药途径与模型病理不同，提示其可经血压非依赖的细胞抗氧化/抗炎通路起效。PRDX2是脑与血管高表达的抗氧化酶，既往知其缺失加重卒中，本研究首次证明芹菜素直接结合PRDX2并稳定其表达，经由PRDX2-Trx1轴维护脑血管完整性。结论：本研究阐明芹菜素-PRDX2-Trx1抗氧化信号通路通过血压非依赖机制防护高血压性ICH，为芹菜素类脑血管药物开发提供机制基石，亦为临床转化提供新切入点。