《Plant Stress》：Time-course transcriptomic and proteomic analysis reveals dynamic regulation landscape of maize salt-alkali tolerance
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摘要翻译：
土壤盐渍化和碱化是全世界玉米生产的主要威胁。为了解析耐盐碱性背后的动态分子响应和共表达网络，研究人员利用两个耐盐性相反的玉米自交系HCL195（耐盐）和HCL660（敏感）开展了一项时间序列多组学研究。在用100 mmol/L盐碱溶液处理后0、12
摘要翻译：
土壤盐渍化和碱化是全世界玉米生产的主要威胁。为了解析耐盐碱性背后的动态分子响应和共表达网络，研究人员利用两个耐盐性相反的玉米自交系HCL195（耐盐）和HCL660（敏感）开展了一项时间序列多组学研究。在用100 mmol/L盐碱溶液处理后0、12、24、48和72 h采集根部样本进行RNA测序，并在0、24和72 h进行蛋白质定量。HCL195表现出优异的生长以及显著更强且持续的转录响应，在所有胁迫时间点共有2492个基因差异表达，而HCL660中仅有700个。KEGG富集分析显示，苯丙烷生物合成和二萜生物合成通路在两个自交系的所有时间点均显著富集。这些通路中的大多数基因在盐碱胁迫下表现出总体上调并伴随时间动态变化。蛋白质组谱证实了转录组结果，即HCL195维持了更高比例的上调蛋白。转录组-蛋白质组联合分析在HCL195的72 h时间点鉴定出36个共同上调和142个共同下调的协同变化基因。通过构建转录因子（TF）–靶基因共表达网络，研究人员鉴定了7个枢纽TF，它们共同调控271个基因，其中3个已知与耐盐性相关。这些结果强调，由核心TF驱动的关键次级代谢通路和抗氧化模块的持续激活，支撑了玉米的耐盐性。
论文解读：玉米耐盐碱性的时间序列转录组与蛋白质组动态调控研究
盐碱胁迫是限制作物生产的重要非生物逆境之一，而玉米作为全球重要的粮食、饲料和工业原料作物，对盐碱胁迫表现出中等敏感性。中国盐碱地面积巨大，提高玉米耐盐碱性对于盐碱地资源的高效利用具有战略意义。尽管目前已经克隆并鉴定了部分参与离子稳态、渗透调节和活性氧清除通路的耐盐功能基因，但玉米耐盐碱性的分子调控网络仍不完整，大多数基因间的调控关系尚不清楚，且这些调控关系会随盐碱胁迫发生动态变化。以往研究多基于单一或少数时间点采样，难以反映分子响应的动态过程；少数多组学研究在不同组学层之间缺乏严格匹配的时间点；此外，分析常局限于差异基因或通路列表，未构建连接上游转录因子与下游代谢产物的共表达网络。因此，开展动态多组学联合研究，系统解析盐碱胁迫下转录动态与翻译输出之间的关系，具有重要意义。
研究人员以耐盐自交系HCL195和敏感自交系HCL660为材料，在100 mmol/L盐碱溶液（NaHCO?:Na?CO?=5:1，pH 9.0）处理下，于0、12、24、48和72 h采集根部样本进行RNA测序，并在0、24和72 h进行蛋白质定量。通过转录组独立分析、蛋白质组独立分析以及二者的联合分析，研究人员揭示了玉米耐盐碱性的动态调控景观和关键调控节点。该研究发表在《Plant Stress》。
主要关键技术方法包括：利用HISAT2将RNA-seq数据比对到玉米B73参考基因组（B73 RefGen_v4），以DESeq2鉴定差异表达基因（DEGs）；采用数据非依赖采集（DIA）模式的Orbitrap Astral高分辨质谱进行蛋白质组定量，以DIA-NN软件处理质谱数据并鉴定差异表达蛋白（DEPs）；对转录组和蛋白质组数据进行九象限图联合分析，筛选mRNA和蛋白质水平协同变化的基因；通过整合Gene Ontology功能注释和Pfam保守结构域鉴定转录因子（TF），利用Pearson相关系数构建TF–靶基因共表达网络，并结合STRING数据库蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，采用多中心性指标鉴定枢纽基因；最后通过qRT-PCR验证枢纽基因的表达。
研究结果如下：
3.1 盐碱胁迫条件下的表型特征
在40–120 mmol/L浓度梯度处理下，100 mmol/L浓度使敏感自交系HCL660的株高、叶长、地上部鲜重和地下部鲜重均显著下降，而耐盐自交系HCL195在各指标上与对照无显著差异，表明该浓度适于区分耐盐性差异。研究人员据此选定100 mmol/L作为胁迫浓度，并在五个时间点采集根部样本进行转录组测序、三个时间点进行蛋白质定量。
3.2 RNA测序鉴定响应盐碱胁迫的DEGs
转录组数据质量可靠，生物学重复间相关性高（相关系数0.92–1.00），主成分分析（PCA）可清晰区分两个自交系。HCL195在每个时间点的上调基因数均多于下调基因数，且DEG总数大于HCL660；HCL195中2492个基因在所有四个处理时间点均差异表达，HCL660中为700个。KEGG富集分析显示，苯丙烷生物合成和二萜生物合成通路在两个自交系的所有时间点均显著富集；HCL195在这些通路中的上调基因数量高于HCL660，且多数基因表现出随时间波动的总体上调趋势。
3.3 鉴定响应盐碱胁迫的DEPs
蛋白质组PCA同样能区分两个自交系和不同时间点。HCL195在24 h和72 h的上调蛋白数均多于下调蛋白数，与转录组趋势一致；HCL660则在72 h表现出下调蛋白多于上调蛋白。直接比较两个自交系时，HCL660在每个时间点相对HCL195都有更多下调蛋白。DEPs的KEGG富集分析显示，苯丙烷生物合成、糖酵解/糖异生和氮代谢在两个自交系中均显著富集。
3.4 RNA和蛋白质数据联合分析鉴定协同响应基因
在24 h和72 h两个匹配时间点，转录本表达水平与蛋白丰度呈中等正相关（r=0.44–0.54）。HCL195在72 h有32个基因在转录和蛋白水平共同上调和118个基因共同下调。HCL660在72 h有83个共同上调和153个共同下调基因。两个自交系之间共有1个共同上调和9个共同下调基因。共同上调基因富集于次级代谢物生物合成、亚油酸代谢、色氨酸代谢、吲哚生物碱生物合成和苯丙烷生物合成等抗性相关通路；共同下调基因则富集于苯丙烷生物合成、代谢途径、次级代谢物生物合成、苯丙氨酸代谢和糖酵解/糖异生等通路。
3.5 转录因子鉴定与共表达网络构建
研究人员从协同变化基因中鉴定出7个枢纽TF基因（Zm00001d002601、Zm00001d018826、Zm00001d028445、Zm00001d038718、Zm00001d045478、Zm00001d048020和Zm00001d054093），qRT-PCR验证了其转录组表达模式。基于这7个TF与350个协同变化基因的表达相关性，构建了包含519条显著边（|r|>0.7）的TF–靶基因共表达网络，其中171条为激活关系、348条为抑制关系。Zm00001d002601编码一个组蛋白连接蛋白，其靶基因包括三个已知的高置信度耐盐基因：编码苹果酸合酶的Zm00001d003247、编码脯氨酸脱氢酶的Zm00001d029853和编码乙醇脱氢酶1（ADH1）的Zm00001d033931。后两个基因同时也是Zm00001d018826（编码ML结构域蛋白）的靶基因，Zm00001d003247还受Zm00001d028445（编码RADIALIS样TF）和Zm00001d045478（编码组蛋白连接蛋白）的调控。这些多重调控关系表明枢纽TF可能协同调控耐盐相关基因。
讨论部分指出，耐盐自交系HCL195在100 mmol/L盐碱胁迫下未出现显著生长抑制，但发生了广泛的转录重编程，这种早期分子变化与表型耐性之间的解耦提示，耐受型植物在细胞损伤前就启动了包括次级代谢、抗氧化系统和渗透调节在内的保护性转录响应。多时间点RNA-seq设计揭示了HCL195持续维持上调基因多于下调基因的动态模式，表明持续转录激活而非瞬时爆发对非生物胁迫耐受性至关重要。苯丙烷生物合成和二萜生物合成作为两个自交系共有的多时间点富集通路，进一步支持这些次级代谢途径在盐碱胁迫中的核心作用。联合转录组和蛋白质组分析鉴定了随时间增加的协同调控基因，其中苯丙烷生物合成在共同上调和共同下调基因中同时富集，说明该通路的不同组分受到双向调控；亚油酸和吲哚生物碱代谢的特异性上调富集提示活化的信号转导与防御响应，而糖酵解/糖异生的特异性下调富集则反映对中心碳代谢的策略性抑制。通过聚焦在转录和蛋白水平均协同差异表达的转录因子，研究人员构建了包含7个枢纽TF和519条高置信度边的共表达网络，其中多个靶基因与耐盐性相关，苹果酸合酶可能通过乙醛酸循环维持渗透胁迫下的碳再利用，脯氨酸脱氢酶催化脯氨酸降解的限速步骤，ADH1则通过酒精发酵参与氧化还原平衡，暗示这些枢纽TF通过协调多种下游途径共同参与玉米耐盐碱响应。
研究结论：本研究通过时间序列多组学分析，揭示了耐盐玉米自交系HCL195在盐碱胁迫下表现出更强且持续的转录和蛋白质组响应，苯丙烷生物合成和二萜生物合成通路是两个自交系中共有的关键胁迫响应通路；转录组-蛋白质组联合分析鉴定出多个在mRNA和蛋白质水平协同变化的基因，并在其基础上构建了由7个枢纽转录因子调控271个靶基因的共表达网络，其中多个靶基因已知与耐盐性相关。这些结果强调了由核心转录因子驱动的关键次级代谢通路和抗氧化模块的持续激活是玉米耐盐性的重要分子基础。
