《Scientific Reports》：Low-MESF fluorescent reference particles for flow cytometry analysis of extracellular vesicles
编辑推荐：
**摘要**
细胞外囊泡（EVs）作为非侵入性生物标志物，在疾病早期检测方面具有巨大潜力。然而，其临床相关的定量流式细胞术（FCM）分析，因缺乏具有低单颗粒荧光值的合适校准颗粒而受到限制。尽管硅胶颗粒的荧光标记已十分成熟，但传统方法在低MESF（可溶性荧光素
**摘要**
细胞外囊泡（EVs）作为非侵入性生物标志物，在疾病早期检测方面具有巨大潜力。然而，其临床相关的定量流式细胞术（FCM）分析，因缺乏具有低单颗粒荧光值的合适校准颗粒而受到限制。尽管硅胶颗粒的荧光标记已十分成熟，但传统方法在低MESF（可溶性荧光素当量分子数）范围内通常产生异质性荧光团分布，而这正是单个EV荧光校准所必需的。为此，研究人员引入了一种标记策略，通过使用荧光标记的硅胶结合肽（R5-FITC）来克服这一局限，制备具有均匀低水平荧光团覆盖的亚微米硅胶颗粒。研究人员合成了三种不同尺寸的硅胶颗粒，并以快速、直接的方式完成标记。经过全面表征，FCM研究表明，所得暗荧光硅胶颗粒（低至278 MESF，且分布狭窄）适用于校准从红细胞中分离的EV的荧光强度。研究结果表明，在尺寸和荧光方面均类似于EV的荧光颗粒，可以提高校准准确性，并促进基于FCM的EV表征标准化。
**论文解读：用于细胞外囊泡流式细胞术分析的低MESF荧光参考颗粒研究**
**一、研究背景与问题**
细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是由细胞释放的纳米级颗粒，在细胞间通讯中发挥关键作用。它们携带蛋白质和核酸，参与多种生理及病理过程，如免疫调节、肿瘤进展和神经退行性疾病传播等。由于EV存在于所有体液中，其作为非侵入性生物标志物在疾病早期检测方面具有巨大潜力。然而，EV在生物物理、生化和功能上高度异质，不同生物发生途径和释放细胞类型使得其尺寸、组成和浓度存在广泛差异，这给检测和标准化带来了显著挑战。
当前，各种技术已用于EV的尺寸表征和表型分析，包括透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和流式细胞术（FCM）等。其中，FCM是一种高通量、单颗粒分析技术，每秒可分析数千个颗粒，结合了尺寸、浓度和基于荧光的表型分析，因此被广泛应用。然而，FCM的一个关键问题在于光散射和荧光强度以任意单位报告，难以准确测定EV的尺寸和单个囊泡上抗原数量。实现FCM实验室间EV测量可比性的核心在于校准，这需要与EV（经荧光抗体标记）的光散射和荧光特性接近的参考颗粒，将测量值从任意单位转换为绝对单位，如MESF（可溶性荧光素当量分子数）。
定量FCM中已有的荧光校准方法通常采用标记已知量荧光团的参考微粒。但这些微粒是为细胞分析而开发，其MESF值远高于典型的抗体标记EV。虽然近年来出现了一些较小尺寸、较低MESF值的商业颗粒（如Invitrogen?的ViroCheck纳米颗粒参考试剂盒和Spherotech的SPHERO?彩虹校准颗粒），但与EV分析相关的低MESF区域仍然缺乏合适的参考颗粒覆盖，使用时不得不将校准的荧光强度外推至EV范围。由于不同参考微粒组间线性回归斜率的微小差异，外推常导致EV的MESF值计算出现显著偏差。因此，开发尺寸和荧光特性更匹配EV的亚微米级荧光颗粒，可作为EV的FCM表征中填补空白的参考颗粒。
硅胶颗粒因其合成简便、胶体稳定性优异和尺寸可调，常被用作参考标准。然而，在保持胶体稳定性的同时实现亚微米硅胶颗粒的荧光表面修饰是困难的，传统涉及溶剂交换的多步骤方法耗时且常导致不可逆颗粒聚集。硅胶结合肽（SBPs）或硅胶形成肽（SFPs）是在温和水相条件下对硅胶表面具有高结合亲和力的短氨基酸序列，提供了简便的多功能化途径。其中源自silaffin-1蛋白的高度阳离子性19-mer R5肽，以催化硅胶沉淀而闻名，是应用最广泛、研究最深入的SFP。本研究基于此开发了亚微米荧光硅胶颗粒作为EV的FCM表征用荧光参考材料。
**二、研究主要技术方法**
研究人员采用St?ber法合成了三种尺寸（约170 nm、260 nm和400 nm）的单分散亚微米硅胶颗粒。使用标准固相肽合成（SPPS）基于Fmoc化学制备FITC标记的R5肽（R5-FITC），将其在水相室温条件下快速（2分钟孵育）结合至硅胶颗粒表面。对空白和标记颗粒进行了全面表征（TEM、DLS、Zeta电位和荧光发射光谱），并通过与已知浓度荧光素溶液对比确定MESF值。从健康供体全血中根据已发表方案分离红细胞来源EV（REVs），采用多种技术（FF-TEM、DLS、MRPS、FTIR）进行表征。最终使用FCM，利用R5-FITC标记硅胶颗粒作为校准物测定抗体标记REVs的MESF值。样本队列来源为一名健康志愿者的12 mL血液样本（匈牙利医学研究委员会伦理批准）。
**三、研究结果**
**硅胶颗粒的合成、表征和荧光标记**
研究人员利用St?ber法成功合成了三种不同尺寸的单分散亚微米二氧化硅颗粒（SP1约170 nm、SP2约260 nm、SP3约400 nm）。TEM和DL?S分析证实颗粒具有良好的分散性和高度单分散性。Zeta电位测量显示颗粒表面具有高负电位，表明优异的胶体稳定性。将R5-FITC肽添加到硅胶分散液中进行表面修饰后，DLS表明平均流体动力学直径仅发生微小变化，Zeta电位因阳离子R5-FITC肽结合至负电硅胶表面而下降，但胶体稳定性仍得到保持。荧光发射光谱确认了成功修饰，在518 nm处显示FITC特征发射峰。此外，初步实验中R5肽还成功修饰了多种商业硅胶颗粒，表明该策略具有广泛适用性。
**REVs的分离、荧光标记和表征**
依据已发表方案从全血中分离出REVs。FF-TEM显示均匀的球形颗粒形态；DLS测得平均流体动力学直径为223±25 nm；MRPS得出尺寸呈对数正态分布、平均直径为179 nm（标准差36.3 nm），颗粒浓度为7.8×1011个/mL。FTIR光谱显示脂质和蛋白质特征吸收带（酰胺A、酰胺I和酰胺II），其中酰胺I与C-H伸缩区的面积比为2.11±0.03，符合典型REV值。REVs通过FITC偶联的单克隆抗体（抗CD235a-FITC）进行标记。
**FCM研究**
R5-FITC标记硅胶颗粒在FCM的紫色SSC通道中显示单分散颗粒群体。侧向散射强度利用空白硅胶颗粒和Mie理论（通过FCMPASS软件实现）校准为散射截面值。FITC通道中标记颗粒的直方图显示出向更高强度的明显偏移，且峰较窄表明荧光团分布均匀。随颗粒尺寸增大，测量的中位荧光强度（MFI）增加，归因于更大的表面积允许更多R5-FITC肽结合。通过比较标记颗粒与已知浓度荧光素溶液的荧光信号（经颗粒浓度归一化），确定了颗粒的MESF值，最低可达278 MESF且分布狭窄。
对标记REVs的FCM分析显示其散射强度与荧光硅胶颗粒相似，但尺寸分布更宽。由于REVs可能因血红蛋白导致复杂折射率，未将散射信号转换为颗粒直径。REV在FITC通道中向高强度的偏移证实了抗体标记成功。利用硅胶颗粒建立MFI到MESF的校准曲线，测得抗CD235a-FITC标记REVs的荧光强度为390 MESF。对比商业Quantum? FITC-5 MESF校准微粒的校准曲线可见，商业颗粒在低MESF（小于10,000）范围内无法避免外推，而R5-FITC标记硅胶颗粒则提供了无需外推的适宜校准。
**四、结论与意义**
本研究报告了亚微米荧光硅胶颗粒作为EV的FCM表征用荧光参考材料的开发与应用。通过R5-FITC肽以简便、快速的方式标记自合成硅胶颗粒，实现了均匀荧光团覆盖，同时保持了优异的胶体稳定性和高度单分散性。该标记颗粒适用于无需外推的抗体标记EV荧光的MESF校准。研究证实，在尺寸和荧光特性上更匹配EV的亚微米荧光硅胶颗粒，能够填补EV的FCM表征中的参考颗粒空白，提高校准准确性，为推进基于FCM的EV表征标准化奠定了基础。研究发表自《Scientific Reports》期刊。
