《Cell Reports Medicine》：CRISPRa-identified transcription factors reprogram glioblastoma into dendritic cell-like cells to elicit systemic antitumor immunity
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尽管免疫疗法已改变多种癌症的治疗格局，但其在胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）中的疗效受到肿瘤微环境中抗原呈递不足和免疫原性细胞排斥的限制。在此，研究人员开发了一种基于候选基因的CRISPR激活（CRISPR activation, CRISP
尽管免疫疗法已改变多种癌症的治疗格局，但其在胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）中的疗效受到肿瘤微环境中抗原呈递不足和免疫原性细胞排斥的限制。在此，研究人员开发了一种基于候选基因的CRISPR激活（CRISPR activation, CRISPRa）功能筛选，以鉴定常规树突状细胞（conventional dendritic cell, cDC）命运决定的调控因子。研究人员确定转录因子Zfp366/Znf366、Pu.1、Irf8和Batf3（ZPIB）足以将GBM细胞转化为cDC样细胞。ZPIB介导的重编程导致胶质瘤细胞发生全局转录和表观遗传重塑。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）分析还揭示了GBM细胞在体内向cDC的高效且动态的重编程。此外，重编程的肿瘤细胞重塑微环境，并在多种小鼠GBM模型中引发系统性肿瘤根除和持久抗肿瘤免疫。ZPIB-DC引发的抗肿瘤免疫与免疫检查点抑制剂具有协同作用。最后，研究人员通过在人类化模型中从GBM患者生成ZPIB-DC来评估该方法的临床适用性。该研究代表了一种具有广泛临床免疫治疗意义的细胞重编程治疗策略。
**论文解读：CRISPRa筛选的转录因子将胶质母细胞瘤重编程为树突状细胞样细胞以引发系统性抗肿瘤免疫**
**研究背景与科学问题**
胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）是最致命的中枢神经系统原发肿瘤，尽管采取手术、放疗和化疗等积极治疗，患者中位生存期仍不理想，复发后预后更差。免疫治疗已在多种实体瘤中取得突破，但在GBM中疗效有限，主要原因包括肿瘤突变负荷低、树突状细胞（dendritic cell, DC）抗原呈递功能缺陷以及肿瘤微环境中免疫细胞浸润和激活不足。细胞重编程技术通过重塑细胞转录和表观遗传网络，可将一种细胞命运转变为另一种细胞命运，为肿瘤治疗提供了新思路。然而，以往的肿瘤细胞重编程策略多聚焦于直接降低肿瘤细胞恶性程度或诱导其分化为无关细胞类型，且要求成功转化大多数肿瘤细胞，重编程效率和递送效率均面临挑战。因此，亟需开发一种能同时降低肿瘤致瘤性并诱导肿瘤内免疫激活的重编程策略，以增强癌症免疫治疗疗效。
**研究概述与总体结论**
研究人员开发了一种基于候选基因的CRISPR激活（CRISPRa）功能筛选，在人和小鼠胶质瘤细胞中系统筛查DC命运决定的关键转录因子，鉴定出Zfp366/Znf366、Pu.1、Irf8和Batf3（ZPIB）四因子组合足以将GBM细胞高效重编程为常规树突状细胞（cDC）样细胞（称为ZPIB-DC）。ZPIB-DC具备专业抗原呈递、交叉呈递和T细胞激活功能，在多种小鼠GBM模型中引发系统性、持久且不依赖内源性cDC1的抗肿瘤免疫。通过脂质纳米颗粒（LNP）递送ZPIB mRNA实现原位重编程，并与抗PD-1（αPD-1）协同增强疗效；在患者来源GBM细胞和人源化模型中验证了临床适用性。该研究发表于《Cell Reports Medicine》，代表了一种具有广泛临床转化前景的细胞重编程免疫治疗策略。
**主要技术方法**
研究人员采用的关键技术包括：基于候选基因的CRISPRa功能筛选（慢病毒文库覆盖26个DC相关转录因子，经CD45/CD11c/MHCII流式分选和深度测序鉴定候选因子）；RNA测序（RNA-seq）与转座酶可及性染色质高通量测序（ATAC-seq）解析转录及表观遗传重塑；单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合RNA velocity和Monocle 3轨迹分析体内重编程动态；转铁蛋白修饰的脂质纳米颗粒（LNP）递送ZPIB mRNA实现原位重编程；质谱流式（CyTOF）高维免疫分型。动物模型包括同系C57BL/6小鼠、Batf3
?/?小鼠、Nestin-tva/Ink4a/Arf
?/?自发胶质瘤模型及人源化C-NKG小鼠模型。患者来源GBM细胞来自西京医院手术标本（经第四军医大学伦理委员会批准），其中GBM03和GBM07两个PDX模型成功建立并用于研究。
**研究结果**
**1. CRISPRa筛选揭示了将胶质瘤细胞重编程为cDC样细胞的最佳转录因子网络**
通过CRISPRa文库筛选，Pu.1（Spi1）、Zfp366/Znf366、Batf3、Irf8的sgRNA在人和小鼠胶质瘤细胞中均高度富集；在PIB基础上加入Zfp366/Znf366可显著提高cDC重编程效率。ZPIB转导后，GL261和LN229细胞出现CD45+MHCII+细胞群，表达cDC特异性标记CD11c、CLEC9A和XCR1，呈典型树突状形态，获得吞噬、抗原加工和交叉呈递能力，分泌IL-15、IL-12p70等促炎细胞因子，并能激活初始CD8+ T细胞、介导对胶质瘤细胞的细胞毒性杀伤。
**2. ZPIB介导的重编程诱导胶质瘤细胞全局转录和表观遗传重塑**
RNA-seq显示ZPIB快速上调cDC特异性基因，富集于IFN-β/IFN-γ信号和免疫应答通路；基因集富集分析（GSEA）表明细胞周期信号通路显著受抑，胶质瘤细胞丧失增殖特征。ATAC-seq显示cDC相关基因位点（如Clec9a、Xcr1、H2-ab1）染色质可及性增加，开放区域富集Pu.1、Batf3和Irf8结合基序。体外软琼脂克隆形成实验和免疫缺陷小鼠颅内成瘤实验均证实ZPIB-DC失去致瘤能力。
**3. ZPIB-DC引发系统性肿瘤根除和持久抗肿瘤免疫**
在免疫缺陷Rag1
?/?小鼠中，诱导ZPIB仅延长生存但不能根除肿瘤，表明适应性免疫是疗效所必需。在免疫健全C57BL/6小鼠中，仅5%肿瘤细胞被重编程
