综述：生物分子凝聚介导材料：相态、相转变及生物医学应用

《Bioactive Materials》：Biomolecular coacervation-mediated materials: Phase states, phase transitions, and biomedical applications

　　

摘要：生物分子凝聚（biomolecular coacervation）日益被视为一种相演化过程，包括液-液相分离（liquid-liquid phase separation, LLPS）——形成亚稳态液体样状态——以及相转变——产生凝胶样状态或固体样状态。这些凝聚相态表现出独特的结构、动力学和力学特征，使得生物分子凝聚调控成为一种强大的设计策略，可用于构建适用于广泛生物医学应用的生物材料。在本综述中，研究人员首先总结了LLPS的分类及典型的分子驱动力；随后讨论了凝聚体的相演化，特别强调LLPS、液-凝胶转变和液-固转变，液态、凝胶态和固态的特征，以及调控这些过程的内在分子和环境因素；最后，研究人员考察了不同相态特性如何决定凝聚介导材料的生物医学功能，并列举了在药物递送、生物反应器、仿生粘附和组织工程支架中的代表性应用。希望本综述能够为理解凝聚介导材料作为可编程生物分子凝聚系统提供一个统一框架，并指导其在生物医学应用中的合理设计。

1. 引言

生物分子凝聚调控已成为一种构建生物材料的多功能策略，这类材料具有低界面张力、自适应粘弹性、区室化能力或可编程刺激响应行为，在药物递送、生物反应器、仿生粘附和组织工程支架等广泛生物医学应用中极具吸引力。这些凝聚体独特的材料性质从根本上源于其动态相行为，对此的概念理解已从早期胶体化学发展到当代对生命系统中生物分子凝聚体的研究。图1展示了凝聚体相演化和相态关键突破的时间线，以及相行为理论模型的发展。凝聚概念起源于胶体化学，Bungenberg de Jong和Kruyt于1929年将凝聚体定义为部分失去自由流动性但仍保留内在流动性的液体。2009年，线虫P颗粒液-液相分离的发现引发了人们对胞内凝聚（细胞生物学中称为生物分子凝聚）的广泛关注。随着对胞内凝聚系统的深入研究，生物分子凝聚日益被视为一个相演化过程，包括导致亚稳态液体样状态的LLPS，以及产生凝胶样状态或固体样状态的相转变（液-凝胶和液-固转变）。类似的相演化途径也广泛存在于细胞外系统中，如贻贝足丝、沙塔蠕虫胶、弹性蛋白纤维和蜘蛛丝，其中生物分子前体首先凝聚成流体凝聚相，随后经历相转变为凝胶样或固体样状态，突显了生物分子凝聚调控作为针对不同功能需求构建生物材料的有力设计策略。受生物凝聚系统启发，研究人员已开发出基于工程化重组蛋白/多肽、化学合成肽/多肽以及化学修饰天然蛋白的生物材料，应用于广泛的生物医学领域。因此，有必要系统梳理当前关于生物分子凝聚体相演化的知识，并阐明不同相态特性如何支配其生物医学功能。

2. LLPS的分类和分子驱动力

2.1 LLPS的分类

LLPS可大致分为三类：分离型（segregative）、缔合型（associative，即复合凝聚，complex coacervation）和简单凝聚（simple coacervation）（图2）。分离型相分离中，不同可溶物种之间的互斥或不相容驱动其分配至不同相，每相富集一种组分。缔合型相分离通常称为复合凝聚，源于化学性质不同的大分子（最典型的是带相反电荷的聚电解质）之间的吸引相互作用，其热力学驱动力主要来自反离子释放相关的熵增，使该过程对离子强度、离子种类、pH和电荷化学计量高度敏感。相比之下，简单凝聚涉及单一分子种类的自浓缩，常见于具有无序区域的蛋白质，由疏水效应、芳香堆积和氢键等多种弱力驱动。

2.2 LLPS的分子驱动力

LLPS受多种弱相互作用的协同和竞争支配，代表了熵和焓贡献之间的微妙平衡。静电相互作用是复合凝聚的主要驱动力，且对pH和离子强度高度响应。例如，pH诱导贻贝足蛋白Mfp-5中赖氨酸残基去质子化，降低分子内静电排斥并促进水下粘接的液-凝胶转变。氢键，特别是涉及Dopa残基的动态网络，在高盐或极端pH条件下增强凝聚体稳定性。合成肽可通过酶促将Tyr转化为Dopa以增强凝聚稳定性。疏水相互作用由释放有序水分子的熵增益驱动，既介导功能性组装（如tropoelastin）也介导病理性聚集（如FUS和TDP-43），其中疏水斑块在稠密相中的富集促进成核和淀粉样纤维形成。此外，阳离子-π相互作用（特别是Arg-Tyr相互作用）以及芳香族氨基酸之间的π-π堆积进一步增强分子间内聚力和凝聚体稳定性。

3. 凝聚体相演化与相态

生物分子凝聚是一个非平衡动力学过程，可持续演化并表现出不同相态（图3A）。本节代表性实例主要来源于胞内蛋白凝聚体，尤其是 intrinsically disordered proteins（IDPs）形成的系统，因为这些系统提供了将LLPS与后续相转变联系起来的成熟实验模型。值得注意的是，一些ECM蛋白（如胶原、弹性蛋白）和分泌型粘附系统（如贻贝足蛋白、沙塔蠕虫胶）可经历类似演化，但因其相行为表征有限，本节不作详细讨论。

3.1 凝聚体相演化：LLPS和相转变

相演化通常始于LLPS驱动的亚稳态液体样状态形成，随后可能沿两条不同途径演变为凝胶样状态或固体样状态（图3B）。

LLPS：在特定环境条件（如pH、温度、离子强度）下，均相溶液自发分离成两个或多个具有不同分子浓度的液相区域，由多种弱非共价相互作用驱动。根据能量最小化原理，生物分子LLPS通常通过两个过程实现：分子间相互作用的焓贡献和离子与水分子重排产生的熵驱动力。如果分子间有效吸引作用太弱而无法克服混合熵损失，则不会发生相分离。初始形成的富集相通常表现为包含高浓度生物分子的微米级球形液滴，但仍处于亚稳态。

LLPS形成的微液滴系统具有高界面能，通过两种主要途径自发粗化以降低系统总自由能：1) Ostwald熟化，由Gibbs-Thomson效应驱动；2) 聚并，液滴通过布朗运动碰撞并融合。环境扰动或溶液条件变化可显著影响粗化动力学。达到一定尺寸后，微液滴可能发生沉降，导致宏观分离的连续稠密相和稀相。无论是否经历宏观相分离，这些微观液滴在此统称为“液体样凝聚体”。

相转变：随时间或环境条件变化，凝聚液相发生相态变化，主要有两条途径：1) 液-凝胶转变，液体样凝聚体转变为动力学阻滞的凝胶样状态，典型特征是形成逾渗网络（percolated network）。许多含低复杂度结构域（LCDs）的IDP（如FUS、hnRNPA2）在体外表现出可逆液-凝胶转变，其由stickerspacer架构调控。工程生物材料利用相同的架构原理实现可编程液-凝胶转变。2) 液-固转变，液体样凝聚体转变为热力学终态或动力学阻滞的固体样状态，典型特征是形成富集β-折叠的淀粉样或类淀粉样纤维。此过程常见于神经退行性疾病相关病理蛋白（如α-突触核蛋白、TDP-43、hnRNPA1）。LLPS衍生的微液滴可作为关键的“预聚集体”：一方面大幅提高凝聚体内局部蛋白浓度；另一方面液滴界面提供独特的表面环境，可显著降低成核屏障，加速淀粉样纤维的成核和延伸。

总之，凝聚体相演化主要产生三种不同相态：液体样、凝胶样和固体样。这些相态应被视为凝聚体相演化过程中的代表性特征状态，而非严格分割的类别，单个凝聚系统可能同时表现出多种相态特征。

3.2 凝聚体相态：液体样、凝胶样和固体样

液体样状态是通过LLPS形成的稠密液相，其中生物分子通过弱瞬时连接相互作用，表现出高分子动力学。特征包括：1) 高度内部动力学，通常通过荧光恢复后光漂白（FRAP）量化；2) 低界面张力（典型范围1-1000 μN/m），液滴呈球形并可在接触后数秒内融合；3) 粘度范围宽（合成聚电解质凝聚体约0.1-1000 Pa·s，生物分子凝聚体类似）。这些特征赋予液体样状态工程价值：高分子迁移率有利于分子运输，低界面张力和粘度有利于在复杂生物表面润湿和共形接触。

凝胶样状态是液-凝胶转变形成的状态，其中生物分子形成系统跨度的逾渗网络，使生物分子处于动力学约束状态，同时保留一定程度分子重排和动力学。特征包括：1) 受限的分子动力学，表现为缓慢且不完全的FRAP恢复以及扩散系数显著降低；2) 弹性主导的粘弹性，表现为G′>G″。凝胶样凝聚体通常占据中间状态，能够平衡力学支持与动态适应性。

固体样状态是通过液-固转变形成的组装体，其中生物分子通过持久连接相互作用，导致分子迁移率严重降低或丧失。特征包括：1) 高度有序或致密堆积的架构，常见于淀粉样纤维或类淀粉样原纤维组装，β-折叠富集并形成持久分子间网络，弹性模量约10⁷-10¹⁰ Pa；2) 严重降低或丧失的分子动力学，FRAP无可观察恢复，扩散系数接近零。这些特征为需要长期结构稳定性和力学增强的凝聚体生物材料提供了可迁移框架。

4. 凝聚的内在分子和环境调控策略

4.1 内在分子调控

序列特征、构象状态、局部结构有序性和化学修饰共同调节分子间相互作用和凝聚行为。

序列编码调控（突变和基序模式）：sticker-spacer模型广泛用于理解序列组成和基序模式如何控制凝聚行为。关键残基突变可改变stickers的同一性、价数和亲和力。例如FUS中芳香残基（典型Tyr）和正电荷残基（Arg）作为经典stickers，其替换为弱吸引氨基酸会抑制或消除凝聚体形成；而致病性点突变（如Gly156→Glu、Arg244→Cys）增强分子间亲和力，加速老化动力学。Spacer区域的突变通过改变骨架柔性、溶剂化性质影响相行为。此外，相互作用基序的空间分布至关重要：电荷分离（如LAF-1 RGG结构域中的电荷模块化架构）能显著增强相分离倾向；芳香残基的均匀分布有利于动态液体样凝聚体，而聚集分布则促进动力学阻滞和固体样转化。

分子识别介导的构象重排：IDPs填充动态构象系综，系综变化可影响凝聚行为。膨胀态构象促进分子间接触和LLPS，紧凑构象抑制相分离。核酸、蛋白伴侣和金属离子等结合事件可驱动构象系综改变，如G3BP1在RNA结合后发生构象膨胀约13%并驱动LLPS；Zn²⁺结合α-突触核蛋白诱导单体构象紧实并加速淀粉样聚集。构象调控直接影响相互作用基序的有效价数和可及性。

有序结构基序的掺入：将β-折叠形成或α-螺旋片段掺入无序蛋白可调节相行为。局部刚性基序增加分子间接触持久性，限制稠密相内扩散，使凝聚体偏向更稳定、更低动态的状态。例如，在FUS液滴中引入形成纤维β-折叠核的短肽（Q4、N4）可在数分钟内转化为非球形固体聚集体；在ELP中嵌入12.5%-50%有序聚丙氨酸α-螺旋可组装成粘弹性凝胶网络。

化学修饰介导的调控：翻译后修饰（PTMs）通过添加、去除或转化侧链官能团调节凝聚行为，如Tau乙酰化抑制LLPS和聚集，FUS精氨酸甲基化调节LLPS和凝胶化。此外，化学修饰策略可有意引入光响应基团、共价交联基团、硫醇/二硫键基序等，赋予凝聚体可编程控制。例如含偶氮苯的ELP实现光控相转变；二硫键赋予氧化还原响应性，可在还原条件下解组装并释放药物。

4.2 环境调控

pH通过调节可电离残基质子化状态调控静电相互作用。局部pH波动可作为关键调控信号，例如胞内酸化可诱导细胞质从“流体样”向“固体样”流变转变。材料设计中，将可电离氨基酸掺入温度敏感ELP可实现pH-温度联合调控。

离子强度通过电荷筛选效应调控静电介导的凝聚。经典复合凝聚中，离子强度增加削弱库仑吸引，缩小相分离窗口。在多驱动力协同系统中，高离子强度可屏蔽分子间静电排斥，同时促进疏水和π-π相互作用，如GY23肽的G′随离子强度增加而增加。

温度通过改变分子间吸引、溶剂熵和链构象熵的相对贡献调控凝聚，表现为UCST或LCST行为。复合凝聚通常呈UCST（焓驱动），而疏水效应主导的简单凝聚呈LCST（熵驱动）。ELP是经典LCST模型系统。

大分子拥挤通过排斥体积效应和 depletion效应增加生物分子的有效浓度并产生耗散吸引力，可在更低固有浓度下触发LLPS，并促进向凝胶样或固体样转变。

剪切调控凝聚动力学和相演化途径。剪切应力可介导液体样凝聚体向高度取向的纤维状固体的转变，如FUS纤维在临界剪切应力0.5 Pa下获得35 MPa拉伸强度。

综上，内在分子调控中官能团修饰更具实践可调性，而其他策略主要提供机制认识；环境调控中pH和温度因其可匹配生理或病理微环境而具有生物医学应用吸引力。

5. 凝聚介导材料的生物医学应用

不同凝聚相态具有可利用的特定性质。液体样凝聚体具有动态区室化、高分子迁移率、低界面张力和粘性主导行为；凝胶样状态提供水合互连粘弹性网络，兼具力学支持和分子动力学保持；固体样区域通过致密堆积或纤维架构提供持久增强和长期稳定性。

5.1 药物递送平台

液体样凝聚体的区室化能力和可变形性可实现治疗药物的高效招募与富集，微米级肽基凝聚体可通过非内吞途径穿透细胞膜。然而，其高迁移率和热力学亚稳定性可能损害生理条件下的结构稳定性和货物保留。为此发展多种刺激响应策略：磁性纳米颗粒负载凝聚体可在交变磁场下释放；氧化还原响应凝聚体在胞内谷胱甘肽还原环境中快速解组装；酶响应系统通过酶促反应引起局部酸化触发解组装；Staudinger反应响应凝聚体经生物正交反应在2小时内完全解组装。界面功能化可改善靶向性，如多酚-肽网络包被的凝聚体实现配体介导主动靶向。值得注意的是，合理相态调控成为平衡分子动力学与货物保留的有效策略。例如，SEND-FR纳米点在碳酸氢盐刺激下发生液-固转变，形成硬化颗粒，在100%血清中仍保留约83%的负载BSA-FITC。具有核-壳多相结构的液体样凝聚体也能增强液体核稳定性并实现长期药物储存。

5.2 生物反应器

凝聚体生物反应器利用LLPS的区室化能力创建无膜反应室，具有受限空间但高内部动力学，可实现酶和底物富集。例如，相分离区室可将酶促反应提高达36倍；限制在动态区室的发夹状催化肽P7通过构象调整使催化效率提高15,000倍。简化二肽凝聚体可封装金属催化剂实现生物正交催化。细胞内多酶凝聚体已用于促进萜类生物合成；此外，凝聚体还可通过局部调节理化环境（如维持碱性微环境）拓宽酶的操作pH窗口，并实现pH最适条件不相容酶之间的级联催化。然而，随时间演化，凝聚体从液体样向固体样转变会导致催化效率下降。

5.3 仿生粘附

仿生粘附利用液体样状态的适应性润湿和界面共形能力，以及后续凝胶样网络提供的内聚支撑。贻贝足蛋白分泌后形成液体样凝聚体，经环境信号触发凝胶化形成稳定水下粘附层。例如，Dopa修饰的MFP5衍生多肽GK-16*在pH 7.4时粘附力比pH 3时提高约15倍。藤壶启发的简单凝聚系统通过氢键和疏水相互作用在极端pH和离子强度下保持稳定，并通过光固化实现强粘附。TDP43 LC-Mfp5融合蛋白在4°C经历时间依赖性液-固转变为致密淀粉样纳米纤维涂层，其界面能更低、润湿性更好，粘附力和粘附能比25°C直接形成的稀疏纤维高近一个数量级。

5.4 组织工程支架

天然组织中，细胞外基质（ECM）网络提供承载能力并动态重塑。弹性蛋白前体tropoelastin经历LLPS形成液体样凝聚体，随后通过共价交联转变为凝胶样网络。基于明胶的凝聚模型通过增加疏水价数增强LLPS倾向，光诱导共价交联使液-凝胶转变形成具有硬（约150-200 kPa）软（<50 kPa）域的非均质动态网络，促进干细胞铺展。ELP通常需与其他基序组合形成水凝胶网络，如引入点击反应分子后储能模量可调至100-1000 Pa。双疏水ELP系统GPG加热至45°C时从球形颗粒转变为富含β-折叠的纤维结构（直径20-70 nm）。液体样凝聚体可与高强度增强相（如CNFs、CNCs）协同形成仿生复合支架。

总之，应根据应用功能需求选择性利用或协调相态特征：药物递送需要高效包载、保留和受控释放；生物反应器需要区室化、富集和分子迁移率；生物粘附需要界面润湿和持久保留；组织工程需要水合支撑微环境和力学支持。

6. 总结与展望

生物分子凝聚通常始于LLPS形成亚稳态液体样凝聚体，随后可经历液-凝胶和液-固转变，产生具有不同材料性质的凝胶样或固体样状态。这些相态特征具有应用依赖性权衡：液体样提供动态性和润湿性但稳定性有限；凝胶化增强结构完整性但可能损害可注射性和组织重塑；固体样增强长期力学稳健性但可能降低降解性和生物相容性。当前挑战包括：1) 现有分子设计原则对预测LLPS是否发生较有效，但对编程相转变方向指导有限；2) 分子序列、相互作用寿命、介观组织和宏观材料性质之间的机制关系仍不明确；3) 转化挑战包括Dopa基凝聚体在生理条件下的自氧化和血清蛋白竞争吸附、天然蛋白来源差异和免疫原性、重组蛋白的制造复杂性、DNA凝聚体的先天免疫识别等。未来方向包括：1) 超越经典氨基酸设计，整合序列工程与残基修饰、合成侧链和杂化聚合物架构，并借助人工智能/机器学习实现上下文依赖性相行为预测；2) 建立预测性机制联系；3) 从高分子化学和软物质物理中借鉴嵌段架构、超分子交联、动态共价化学和层级组装等设计原则。