包含CD28、4-1BB和CD27的三重共刺激GD2-CAR T细胞在实体瘤模型中介导强效细胞毒性并减少耗竭

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Triple-costimulatory GD2-CAR T cells incorporating CD28, 4–1BB and CD27 mediate potent cytotoxicity and reduce exhaustion in solid tumour models

　　

双唾液酸神经节苷脂（GD2）是经证实的适用于嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗的肿瘤相关抗原；然而，大多数GD2-CAR构建体仅携带有限的共刺激信号，这可能限制其疗效和持久性。研究人员设计了基于人源化hu3F8的GD2-CAR T细胞，携带双重或三重共刺激结构域——GD2–28BBζ（CD28/4-1BB）、GD2–28.27ζ（CD28/CD27）和GD2–28BB27ζ（CD28/4-1BB/CD27）——并比较了它们对GD2阳性神经母细胞瘤（SK-N-AS）、肺腺癌（A549）和视网膜母细胞瘤（Y79和WERI-Rb-1）细胞的体外功能。三种CAR T细胞均能介导针对GD2阳性细胞系的抗原特异性细胞毒性，同时不杀伤GD2阴性靶细胞。在最低效靶比下，GD2–28BB27ζ T细胞对SK-N-AS细胞仍保留显著杀伤能力，而第三代构建体在此条件下已丧失该能力，表明其在效应细胞受限条件下具有强效细胞毒性；相比之下，GD2–28.27ζ T细胞表现出最强的增殖能力，在WERI-Rb-1模型中达到显著差异。在抗原刺激下，GD2–28BB27ζ T细胞在维持细胞毒性的同时，其IL-2、IFN-γ和TNF-α分泌量低于其他构建体，表明其裂解功能与效应细胞因子输出解偶联。在连续肿瘤再挑战实验中，GD2–28BB27ζ T细胞维持了细胞溶解功能，获得的激活和耗竭标志物（CD69、TIM-3，以及与GD2–28BBζ相比的LAG-3；PD-1无变化）更少，更好地保留了其CAR⁺细胞群，并比其他构建体保留了更大的类初始样（CD45RO^-CD62L⁺）亚群。综上，这些体外研究结果表明，在单个CAR中组合CD28、4-1BB和CD27可在低效靶比下赋予强效细胞毒性、较低的效应细胞因子输出、减少的耗竭标志物获得以及更高的表型持久性，提示GD2–28BB27ζ是治疗GD2阳性肿瘤的一种有前景的构型，值得进行体内评估。

论文解读：三重共刺激GD2-CAR T细胞在实体瘤模型中的功能研究

研究背景与目的：嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中取得了显著成功，但在实体瘤中疗效有限。实体瘤中CAR T细胞面临多重障碍，包括免疫抑制性肿瘤微环境（TME）驱动的T细胞耗竭、免疫检查点分子上调、抑制性细胞因子分泌，以及CAR设计本身的局限——尤其是胞内共刺激结构域的配置。GD2（双唾液酸神经节苷脂）是一种在神经外胚层和间充质来源肿瘤中高表达的肿瘤相关抗原，在正常成人组织中表达受限，主要局限于外周神经纤维，因此成为实体瘤免疫治疗的有吸引力的靶点。既往GD2-CAR设计多采用第二代或第三代结构，含有单个或两个共刺激结构域，但持久性和疗效不稳定。部分第三代GD2-CAR（如CD28/4-1BB或CD28/OX40）已在临床评估，总体疗效仍有限。已有研究表明，CD27作为肿瘤坏死因子受体超家族成员，对T细胞活化、生存和记忆形成至关重要，且与CD28信号协同增强T细胞增殖、细胞因子产生和持久性。然而，将CD28、4-1BB和CD27整合于单个GD2-CAR中的研究尚未见报道。基于研究人员前期在血液肿瘤和实体瘤模型中验证的第四代CAR（28BB27ζ）的优越性能，本研究假设GD2特异性第四代CAR（GD2–28BB27ζ）可增强抗肿瘤疗效和功能持久性。

研究方法概述：本研究使用健康志愿者外周血单个核细胞（PBMCs）来源的原代人T细胞，通过慢病毒转导生成CAR T细胞。主要技术包括：构建携带不同共刺激结构域的CAR表达载体；慢病毒包装与转导；流式细胞术检测CAR表达、T细胞亚群、激活和耗竭标志物；免疫印迹验证全长CAR蛋白表达；免疫荧光和共聚焦显微镜评估GD2表达；结晶紫染色和荧光素酶报告基因法测定细胞毒性；CFSE稀释法检测T细胞增殖；ELISA检测细胞因子分泌；连续肿瘤再挑战实验评估功能持久性。样本来自健康志愿者，研究经Siriraj机构审查委员会批准。

研究结果：

（1）GD2在神经母细胞瘤、肺腺癌和视网膜母细胞瘤细胞系中高表达。通过免疫荧光和流式细胞术检测，SK-N-AS、SH-SY5Y、A549、Y79和WERI-Rb-1细胞表面GD2阳性率超过95%，而ARPE-19和HeLa-CD19细胞为GD2阴性，证实GD2在这些肿瘤细胞系中呈高密度、肿瘤限制性表达。

（2）第三代和第四代GD2-CAR构建体的生成及在HEK293T细胞中的表达验证。构建了GD2–28BBζ（CD28/4-1BB）、GD2–28.27ζ（CD28/CD27）和GD2–28BB27ζ（CD28/4-1BB/CD27）三种CAR，均含人源化hu3F8单链可变区（scFv）、Myc标签、CD8α铰链和CD28跨膜结构域，胞内信号域依次连接CD3ζ。免疫印迹证实全长CAR蛋白表达，流式细胞术显示各构建体在HEK293T细胞表面表达水平无显著差异。

（3）GD2-CAR T细胞的生成和免疫表型特征。三种GD2-CAR均能以相近效率转导原代人T细胞，最终产物以CD8⁺ T细胞为主，CD4/CD8比约1:2，记忆亚群以效应记忆T细胞（TEM）为主，各构建体间分化谱相似。基础状态下CD69、CD25及PD-1、LAG-3、TIM-3表达在各组间无显著差异，表明该构型引起的非抗原依赖性（tonic）信号较低。

（4）三重共刺激GD2-28BB27ζ CAR T细胞在GD2阳性实体瘤模型中表现出增强的细胞毒性。在结晶紫和荧光素酶细胞毒性实验中，三种GD2-CAR均能抗原特异性杀伤GD2阳性细胞，不杀伤GD2阴性ARPE-19细胞。在SK-N-AS模型中，效靶比5:1时三种构建体杀伤效率相当；在2.5:1时均显著高于对照；在1:1时，仅GD2–28BB27ζ T细胞仍保留显著杀伤能力，而第三代构建体失效。在A549、Y79和WERI-Rb-1模型中，低效靶比下GD2–28BB27ζ T细胞也表现出更好的细胞毒性。

（5）GD2-28BB27ζ CAR T细胞在识别GD2阳性肿瘤细胞后分泌较低水平的效应细胞因子。ELISA检测显示，三种GD2-CAR均以抗原依赖方式分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α。GD2–28BB27ζ T细胞分泌的三种细胞因子均低于GD2–28BBζ和GD2–28.27ζ T细胞，但其细胞毒性并未降低，表明细胞溶解功能与效应细胞因子输出解偶联。

（6）GD2-CAR T细胞在GD2刺激后的持续细胞毒性和增殖。72小时共培养后，三种GD2-CAR均产生显著的抗原特异性杀伤和增殖。其中GD2–28.27ζ T细胞增殖能力最强，在WERI-Rb-1模型中显著高于其他构建体；GD2–28BB27ζ T细胞则兼具细胞毒性和适度增殖。

（7）GD2-28BB27ζ CAR T细胞在连续肿瘤再挑战中维持细胞毒性，减少耗竭并保留更多干细胞样表型。在连续3轮SK-N-AS肿瘤细胞刺激后，GD2–28BB27ζ T细胞相比其他构建体表达更低的CD69、LAG-3和TIM-3，PD-1无差异；其CAR⁺细胞群的保持率显著更高（fold-change 0.62 vs 0.30和0.30），并保留更高比例的类初始样（CD45RO^-CD62L⁺）T细胞亚群。

讨论与结论：本研究表明，CD28、4-1BB和CD27三种共刺激结构域的组合在GD2-CAR T细胞中产生了独特的功能表型：低效靶比下保留细胞毒性、较低效应细胞因子输出、连续抗原刺激下获得更少耗竭标志物并保留更多类初始样细胞。这种细胞毒性与细胞因子分泌的解偶联可能反映了一种信号调控的效应程序，而非功能低下。研究还强调共刺激结构域的排列顺序对CAR功能的影响：膜近端CD28维持效应功能，远端4-1BB和CD27支持生存和记忆形成。局限性包括：研究完全为体外实验，未模拟肿瘤微环境；未进行转录组、表观遗传或代谢分析；记忆亚群仅通过CD45RO和CD62L定义；未评估体内细胞因子毒性。研究结论翻译如下：总之，结合CD28、4-1BB和CD27信号的GD2-CAR T细胞在低效靶比下保留了细胞毒性——而第三代构建体在此条件下已失效——同时产生较低效应细胞因子水平并在连续再挑战中获取较少耗竭标志物。在神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤异种移植模型中评估GD2–28BB27ζ是研究人员正在进行的工作重点。这些特性表明GD2–28BB27ζ是一种有前景的构型；验证其在神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤异种移植模型中的持久性、安全性和有效性将是未来工作的重要焦点。