《Acta Pharmaceutica Sinica B》：In vivo CAR-T therapy: Delivery systems and beyond for addressing expression, persistence, and safety challenges
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体外CAR-T疗法的临床转化受限于其复杂的生产工艺、治疗可及性有限以及与淋巴细胞清除化疗相关的毒性。体内CAR-T策略利用病毒或非病毒载体，在患者体内原位对T细胞进行直接基因重编程，提供了一种有前景的替代方案。本综述系统梳理了阻碍体内CAR-T疗法发展的关键障
体外CAR-T疗法的临床转化受限于其复杂的生产工艺、治疗可及性有限以及与淋巴细胞清除化疗相关的毒性。体内CAR-T策略利用病毒或非病毒载体，在患者体内原位对T细胞进行直接基因重编程，提供了一种有前景的替代方案。本综述系统梳理了阻碍体内CAR-T疗法发展的关键障碍。研究人员首先总结了影响递送系统和CAR分子靶向能力的因素。在载体方面，研究人员详细阐述了LNPs的组成和理化性质如何将其向性从肝脏转向脾脏，并对基于不同T细胞表面抗原的主动靶向策略进行了关键比较。在CAR分子方面，靶标选择主要由预期疾病决定。此外，研究人员讨论了CAR-T细胞持久性不佳的决定因素，包括不稳定的mRNA载荷和耗竭相关信号通路。针对实体瘤治疗的挑战，研究人员剖析了肿瘤微环境的多方面作用。最后，本综述阐述了病毒和非病毒载体系统引发过度活化和免疫原性的机制。
1. 引言
体外工程化嵌合抗原受体（CAR）T细胞在B细胞恶性肿瘤中的成功改变了过继细胞治疗。然而，其临床应用仍面临制造流程耗时昂贵、需专门设施、细胞因子释放综合征（CRS）及淋巴细胞清除化疗相关毒性等障碍。因此，直接在患者体内生成CAR-T细胞的策略受到关注。当前主要有病毒载体（以慢病毒载体为主）与非病毒系统（以靶向脂质纳米颗粒（LNPs）递送mRNA为主）两大平台。病毒载体可实现持久表达且转导效率高，但免疫原性和制造成本较高；非病毒系统设计灵活、免疫原性低、可装载多种核酸，但表达效率短暂且易被核酸酶降解。全球已有十余种体内CAR-T疗法进入I期临床，但面临精确靶向、可控表达、持久性、肿瘤微环境抑制、过度活化及免疫原性等挑战。
2. 精确靶向：体内CAR-T的载体与CAR逻辑
递送载体需归巢至T细胞富集器官（脾脏、淋巴结、外周血）。被动靶向依赖载体的物理化学性质。LNPs通常由可电离脂质、胆固醇、辅助磷脂和聚乙二醇（PEG）脂质组成。优化粒径（130-170 nm）、表面电荷或采用可电离脂质可改变组织向性。例如选择性器官靶向（SORT）技术通过添加阴离子脂质将LNPs导向脾脏；用磷脂酰丝氨酸替代DOPE可将肝/脾表达比由8:1逆转为1:3。脂质结构与比例也至关重要：含可降解酯键的多支链离子化脂质（如OF-Deg-Lin、L829）偏好脾脏；咪唑基团或哌嗪骨架可增强免疫细胞靶向。主动靶向则通过T细胞表面抗原（CD3、CD5、CD7、CD8）的抗体实现。CD3泛T细胞靶向可转导但易诱发过度激活；CD8限制于细胞毒性T细胞；CD7可同时覆盖NK细胞；CD5因在部分B细胞表达而倾向用于纤维化疾病。载荷介导的靶向包括使用T细胞特异性启动子、将无启动子CAR盒插入T细胞受体α恒定（TRAC）位点，或在mRNA的UTR中引入miR-122结合位点以降低肝脱靶。
3. 提高CAR表达效率
非病毒载体转染T细胞的效率较低，部分原因是内吞和内体逃逸受限。LNPs进入细胞后，可电离脂质在酸性内体环境中质子化，促使膜融合并释放mRNA。新开发的自我降解型聚（β-氨基酯）聚合物也可改善内体逃逸。此外，病毒模拟融合纳米囊泡（FuNVs）可直接与T细胞膜融合，将CAR蛋白呈递到膜上，绕过经典内吞-内体逃逸途径。慢病毒载体的转导效率通常更高，可通过对表面蛋白进行工程改造（如将抗CD3 scFv与CD80/CD58配体结构域融合成MDF蛋白）或使用新型融合糖蛋白MxV-G来增强。小分子雷帕霉素可下调干扰素刺激基因，使慢病毒转导效率提高7.3倍。
4. 持久性障碍及可编程的CAR持续表达策略
线性mRNA易被核酸酶降解，导致CAR表达短暂。环状RNA（circRNA）通过共价闭环结构抵抗外切酶，可延长表达至72小时以上。DNA转座子系统（如mcDNA编码CAR并共递送SB100x转座酶mRNA）可实现基因组整合和持续表达。RNA基因写入技术可在不产生DNA双链断裂的情况下进行RNA引导的基因插入，在T
