细胞周期蛋白E-CDK2通过BRD4调控癌细胞转录程序及免疫治疗反应

《Molecular Cell》：Cyclin E-CDK2 regulates cancer cell transcriptional program and response to immunotherapy through BRD4

　　

细胞周期蛋白E-细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）复合物是驱动细胞分裂的哺乳动物细胞周期机器的一个组成部分。细胞周期蛋白E-CDK2的过度激活在人类癌症中频繁发生。小分子CDK2抑制剂正在癌症患者的临床试验中接受测试。在此，研究人员报道细胞周期蛋白E-CDK2在调控癌细胞整体转录程序方面具有不依赖于细胞周期的功能。CDK2磷酸化含溴结构域蛋白4（BRD4）并调节其染色质结合。癌细胞中细胞周期蛋白E的过表达及由此导致的CDK2激活会改变癌细胞的转录组，抑制干扰素刺激基因（ISGs）的表达，并使癌细胞对免疫治疗产生耐药性。相反，抑制CDK2具有相反的效果，并增强免疫检查点阻断的疗效。抑制CDK2还会增加树突状细胞（DCs）的肿瘤浸润，并增强向CD8 T细胞的抗原交叉呈递。这些研究揭示了细胞周期蛋白E-CDK2在肿瘤发生中的额外功能，并确定使用临床可用化合物抑制CDK2作为增强免疫检查点阻断的策略。

细胞周期蛋白E-细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）复合物是驱动细胞分裂的哺乳动物细胞周期机器的重要组成部分。CDK2最初被认为对细胞增殖必不可少，但基因敲除小鼠及多种癌细胞系研究表明CDK2并非增殖所必需，这限制了CDK2抑制剂的临床适用范围。然而，cyclin E-CDK2过度激活在众多人类癌症中频繁发生，且近期研究发现特定亚群（如CCNE1扩增的高级别浆液性卵巢癌及CDK4/6抑制剂耐药乳腺癌）依赖CDK2增殖，重新引起了靶向CDK2的治疗兴趣。但绝大多数肿瘤类型并不依赖CDK2增殖，使得CDK2抑制剂的治疗应用局限于狭窄亚群。本研究发现cyclin E-CDK2具有不依赖细胞周期的功能：通过磷酸化表观遗传阅读器含溴结构域蛋白4（BRD4）调控癌细胞转录程序，影响干扰素刺激基因（ISGs）表达及免疫治疗反应。研究发表于《Molecular Cell》，揭示CDK2抑制可通过转录重编程增强免疫检查点阻断疗效。

研究人员主要采用以下关键技术方法：利用类似物敏感CDK2（asCDK2）结合硫代ATP类似物标记直接底物；CRISPR-Cas9基因敲除建立CDK2、BRD4、JAK等敲除细胞系；运用小分子抑制剂（tegtociclib、3MB-PP1、JQ1等）进行功能干预；通过RNA测序（RNA-seq）和基因集富集分析（GSEA）表征转录组变化；采用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）及CUT&RUN分析BRD4染色质结合；质谱鉴定磷酸化位点；流式细胞术分析肿瘤浸润免疫细胞；使用同系小鼠移植瘤模型（CT26、MC38、4T1、EMT6）进行体内实验；并利用TCGA、CIDE等人类肿瘤队列数据进行临床相关性分析。

**CDK2 regulates gene expression in cancer cells**
研究人员对六种人癌细胞系及两种小鼠CDK2敲除细胞系进行RNA-seq，发现抑制或敲除CDK2显著改变转录组，且不依赖RB1。GSEA显示“干扰素α应答”和“干扰素γ应答”是最显著富集通路，ISGs（包括CD274，编码PD-L1）表达上调，并通过RT-qPCR验证了靶向效应。

**Altered transcriptional program in cancer cells overexpressing cyclin E**
在过表达cyclin E1或cyclin E1/CDK2的人及小鼠癌细胞中，转录组变化与CDK2抑制相反，ISGs下调。通过敲除CDK2抑制剂p27^Kip1/p21^Cip1激活CDK2同样下调ISGs，证明CDK2活性与ISG表达呈负相关。

**Cyclin E-CDK2 regulates gene expression through BRD4**
LISA分析预测BRD4为关键转录调控因子。利用asCDK2硫代标记证明CDK2直接磷酸化BRD4，质谱鉴定出六个CDK2依赖性磷酸化位点（Thr210、Thr296、Thr847、Ser1045、Thr1186、Thr1212）。表达磷酸化失活突变体BRD4-AA的细胞中ISGs上调，且CDK2抑制剂不能进一步上调，表明CDK2通过BRD4调控ISG表达。

**Cyclin E-CDK2 regulates chromatin binding of BRD4**
ChIP-seq显示CDK2抑制增加BRD4在全基因组范围内的染色质结合，尤其富集于启动子区；cyclin E过表达则降低其结合。CDK2抑制后BRD4在ISG启动子区富集增加，BET抑制剂JQ1可阻断该结合及ISG上调。BRD4-AA突变体同样增强染色质结合，证实CDK2磷酸化BRD4抑制其招募至靶基因。

**Ablation of CDK2 in tumor cells increases the efficacy of immune checkpoint blockade**
在免疫活性小鼠中，CDK2敲除的CT26和MC38肿瘤对anti-PD-1及anti-CTLA-4治疗应答显著增强，肿瘤完全消退比例升高（如CT26模型中anti-PD-1治疗消退率从35%升至75%）。JQ1处理可消除该增强效应。流式分析显示CDK2敲除肿瘤中CD8⁺ T细胞（活化及效应表型）密度增加。

**Systemic inhibition of CDK2 increases the efficacy of immune checkpoint blockade**
对荷瘤小鼠口服CDK2抑制剂tegtociclib联合anti-PD-1抗体显著增强疗效，使多数动物肿瘤完全消退，且未观察到明显毒性，表明系统性药物抑制CDK2可模拟肿瘤特异性敲除的效果。

**Overexpression of cyclin E in tumors confers resistance to immune checkpoint blockade**
cyclin E1过表达的CT26肿瘤对anti-PD-1应答显著降低（生存率从50%降至20%），而tegtociclib治疗可恢复其敏感性。人类肿瘤数据分析显示CCNE1扩增或cyclin E1高表达的肿瘤中干扰素应答通路下调，且CDK2及E型细胞周期蛋白高表达与免疫检查点阻断不良预后相关。

**CDK2 inhibition enhances dendritic cell infiltration and function**
CDK2抑制剂处理增加肿瘤内树突状细胞（DC，包括cDC1和cDC2）浸润，并上调DC表面MHC I类、CD80、CD86等分子表达。体外实验表明cDC1的抗原交叉呈递能力增强。RNA-seq显示CDK2抑制上调DC中干扰素应答基因，而对T细胞数量和功能无明显负面影响。

**讨论与结论**
该研究揭示CDK2兼具细胞周期和转录CDK的特征，通过磷酸化BRD4直接调控ISG表达。cyclin E-CDK2过度激活抑制ISG导致免疫治疗耐药，而CDK2抑制可增强免疫检查点阻断疗效，其机制涉及肿瘤细胞内在转录重编程及树突状细胞功能增强。研究还发现CDK2抑制可恢复cyclin E过表达肿瘤对免疫治疗的敏感性。这些发现扩展了CDK2抑制剂的应用范围，提示不依赖CDK2增殖的肿瘤以及RB1阴性肿瘤也可能从抗CDK2治疗中获益，为CDK2抑制剂与免疫检查点阻断联合治疗多种癌症类型提供了理论基础。研究结论为：CDK2激酶在驱动细胞周期之外，具有非冗余的限速功能控制癌细胞转录程序；CDK2抑制剂的抗肿瘤疗效通过不依赖细胞周期的转录重编程扩展到更广泛的肿瘤类型；CDK2非依赖和RB1阴性肿瘤同样适用抗CDK2治疗，且CDK2抑制与免疫检查点阻断的强协同作用可能将特异性CDK2抑制剂的应用扩展到多种癌症。