《Cell Reports》：Activation of TREM2 via single-domain antibodies improves synaptic and cognitive function in 5×FAD mice
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阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是最常见的神经退行性疾病，髓系细胞触发受体2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）在小胶质细胞中的功能紊乱会增加AD患病风险。
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是最常见的神经退行性疾病，髓系细胞触发受体2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）在小胶质细胞中的功能紊乱会增加AD患病风险。TREM2激活可促进小胶质细胞的保护性功能并减轻AD病理。尽管靶向TREM2的激活型抗体显示出治疗潜力，但TREM2介导的保护性挽救效应的机制仍不清楚。本研究中，研究人员展示了两种靶向TREM2的激活型单域抗体（single-domain antibody，sdAb）10C11和10E12，在携带五种家族性阿尔茨海默病突变（5×FAD）的早期转基因小鼠经腹侧海马注射后，可激活小胶质细胞并挽救认知缺陷。10E12可减少Aβ斑块并维持突触功能，而10C11在不影响斑块负荷的情况下保护突触。两种抗体均降低了AD模型小鼠中的C1q水平，提示TREM2激活在AD中发挥多重功能。综上，本研究提供了两种具有AD治疗潜力的靶向TREM2的sdAb，并揭示了TREM2激活与小胶质细胞调控相关的细胞机制。
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）作为最常见的神经退行性疾病，其病理特征包括细胞外淀粉样蛋白-β寡聚体（Aβ oligomers）和不溶性Aβ斑块的实质沉积、神经元内tau蛋白神经原纤维缠结、神经元丢失及突触功能障碍，共同导致患者记忆丧失和认知衰退。然而，疾病机制认知不足与药物开发困难制约了AD临床治疗的进展。小胶质细胞作为中枢神经系统（central nervous system，CNS）的固有免疫细胞，在AD早期可通过识别和清除Aβ斑块发挥神经保护作用，但慢性激活会释放过量促炎细胞因子（如IL-1β和TNF-α），加剧神经炎症和神经元损伤。全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWASs）已鉴定出多个免疫相关基因变异（如APOE、CD33、TREM2、CR1）为AD的重要风险因素。
TREM2是免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）超家族受体，富集于CNS小胶质细胞，其胞外Ig样结构域可结合脂质、磷脂及Aβ等配体。配体结合后通过TREM2-DAP10/DAP12复合体转导脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，SYK）信号通路，调控趋化、吞噬、增殖、炎症反应及细胞因子分泌等过程。在AD模型中，TREM2缺陷会损害小胶质细胞斑块聚集并减少反应性小胶质增生；而TREM2过表达则可重编程小胶质细胞反应性，改善AD小鼠的神经病理和认知缺陷。近期研究还表明，TREM2在神经退行性变过程中可通过结合C1q抑制补体介导的突触消除。鉴于TREM2在调控小胶质细胞活性和干预AD病程中的关键作用，开发精准靶向TREM2的治疗策略已成为研究热点。
尽管多种TREM2激活抗体已被证明可有效减少AD模型脑组织中的Aβ斑块并改善动物认知行为，但大量证据显示淀粉样斑块负荷与认知缺陷之间的相关性较弱，TREM2激活介导的神经保护机制及其对认知维持或改善的后续效应仍不完全清楚。针对这一科学问题，研究人员开发了两种单域抗体（sdAb）10C11和10E12，与传统单克隆抗体相比，二者具有分子量小、结构稳定和优异的组织穿透能力。在原发性细胞实验中，10E12可激活SYK和AKT信号通路，而10C11仅激活SYK通路。经腹侧海马（ventral hippocampus，vHPC）注射10E12可有效清除早期5×FAD小鼠的Aβ斑块并减轻突触结构与功能损伤，而10C11仅表现出突触保护效应。值得注意的是，两种sdAb均能挽救认知缺陷，提示TREM2的复杂神经保护作用，并表明突触保护可能在早期TREM2介导的认知挽救中占主导地位。该研究为AD治疗提供了有前景的TREM2靶向工具，并为理解TREM2激活及小胶质细胞调控的细胞机制提供了新视角。
研究人员利用噬菌体展示文库技术筛选并制备了靶向小鼠TREM2胞外域（extracellular domain，ECD）的单域抗体候选克隆，通过酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）验证其结合活性，并将阳性克隆与人IgG4（S228P）Fc片段融合。实验采用小鼠骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）评估抗体对细胞活力、迁移及SYK/AKT信号通路的影响；利用短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）敲低Trem2及Fc受体阻断实验验证抗体的TREM2依赖性。体内实验选用雄性5×FAD小鼠及CX3CR1
GFP/+-5×FAD小鼠，通过脑立体定位注射vHPC区给药，结合免疫组织化学、Thioflavin S（ThS）染色和行为学测试评估治疗效果。
**10C11和10E12 sdAbs激活TREM2并提高细胞活力和迁移能力**
通过ELISA筛选获得四个阳性sdAb克隆（2B5、4F12、10C11、10E12）。其中10C11和10E12在10 nM处理后显著增强BMDMs细胞活力，EC50分别为4.147 nM和2.017 nM，优于已有TREM2激动剂报道值。两种sdAb均促进细胞迁移，而2B5和4F12无明显效应。免疫印迹分析显示四种sdAb均增加SYK磷酸化，但仅10E12增强AKT磷酸化。TREM2敲低完全消除两种sdAb诱导的下游信号激活，Fc受体阻断不影响其效应，证实其作用严格依赖TREM2且不依赖Fc介导的次级效应。此外，10C11和10E12均促进BV2细胞中TREM2聚集，且10E12诱导聚集的能力更强。在TREM2表达CHO-K1细胞上，10C11和10E12的结合解离常数（KD）分别为6.13 nM和3.01 nM。两种sdAb还显著增强了原代小胶质细胞的吞噬能力。
**单次注射10E12 sdAb可减少5×FAD小鼠的斑块负荷**
对16周龄5×FAD小鼠vHPC单次注射抗体，24 h后ThS染色显示10E12处理显著减少淀粉样斑块面积，而10C11无此效应。在CX3CR1
GFP/+-5×FAD小鼠中，两种sdAb均增加vHPC区域GFP阳性小胶质细胞数量、胞体直径及斑块周围小胶质细胞聚集，同时降低斑块周围30 μm内P2RY12（稳态小胶质细胞标志物）荧光强度。但仅10E12处理显著降低Aβ斑块数目并增加斑块周围CD68（吞噬活性标志物）表达，10C11未观察到上述变化，表明10C11仅诱导轻度小胶质细胞活化和趋化而不增强吞噬功能。
**持续10E12治疗在5×FAD小鼠中更显著地降低Aβ斑块负荷**
对5×FAD小鼠进行为期2周的持续给药（每2天2 μg/侧）。ThS染色和Aβ免疫组化结果显示，持续10E12治疗使vHPC斑块负荷降低50%–75%，而10C11组无显著减少。斑块大小分层分析显示两种sdAb均重塑斑块尺寸分布，促进小斑块（<25 μm2）扩增并减少大斑块（>25 μm2）。空间分析显示10E12介导的斑块减少延伸至背侧海马（dorsal hippocampus，dHPC）和初级感觉皮层（S1），而10C11的效应严格局限于注射区域。两种sdAb均显著减少斑块相关淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）阳性营养不良神经突。斑块形态分类分析显示10E12将斑块从“致密型”转变为“惰性”形态。两种sdAb治疗均不改变可溶性TREM2（soluble TREM2，sTREM2）水平。
**10C11和10E12 sdAbs改善5×FAD小鼠的认知和社交记忆缺陷**
旷场实验（open field test，OFT）显示各组小鼠运动能力和焦虑水平无差异。新物体识别（novel object recognition，NOR）测试中，16周龄5×FAD小鼠较野生型（wild-type，WT）小鼠表现出物体识别记忆受损，而10C11和10E12治疗均显著改善5×FAD小鼠的识别记忆。三箱社交测试中，5×FAD小鼠存在社交记忆损伤，两种sdAb治疗均显著提高社交记忆偏好指数，表明TREM2激活可改善社交记忆。
**持续10C11和10E12 sdAb治疗抑制5×FAD小鼠Aβ生成**
免疫印迹分析显示，5×FAD小鼠vHPC中Aβ、APP、sAPPα和sAPPβ蛋白水平较WT显著升高，而α-分泌酶（成熟ADAM10）和β-分泌酶（BACE1）无显著变化。10C11和10E12持续治疗均显著降低Aβ和sAPPβ水平，但不改变APP、sAPPα、ADAM10和BACE1的表达。PBS对照与ISO对照组在补体相关蛋白和Aβ生成标志物上无显著差异，排除了Fc驱动的假象。结果表明两种sdAb均可抑制淀粉样蛋白生成性APP切割，减少Aβ产生。
**持续10C11和10E12 sdAb治疗挽救5×FAD小鼠LTP缺陷**
16周龄5×FAD小鼠vHPC中突触后支架蛋白PSD95显著降低，突触前蛋白突触素（synaptophysin）无变化；AMPA受体（AMPAR）亚基GluA1表达无显著差异，但GluA1丝氨酸831位点磷酸化（pS831-GluA1）和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶2α（CaMK2α）磷酸化水平显著降低。两种sdAb治疗均恢复CaMK2α磷酸化水平，10E12还恢复了pS831-GluA1水平，但均未恢复PSD95表达。腹侧海马CA1区场兴奋性突触后电位（field excitatory postsynaptic potential，fEPSP）记录显示，两种sdAb治疗均有效挽救5×FAD小鼠的长时程增强（long-term potentiation，LTP）损伤。
**持续10C11和10E12 sdAb治疗改善5×FAD小鼠的突触丢失**
5×FAD小鼠vHPC中补体蛋白C1q水平显著升高，两种sdAb治疗均显著降低C1q水平。稀疏病毒标记和树突棘形态分析显示，5×FAD小鼠顶树突和基树突的总棘密度和成熟棘密度均显著降低，而10C11和10E12治疗均有效挽救这些缺陷，将总棘和成熟棘密度恢复至WT水平。
**讨论与结论**
研究开发的两种TREM2靶向激动性sdAb均能激活SYK信号、促进小胶质细胞增殖并改善5×FAD小鼠的突触功能和认知表现。10C11虽不激活AKT通路、不促进Aβ斑块清除，仍能发挥突触和认知保护作用，提示两种抗体可能识别TREM2不同表位、触发不同下游信号通路。AlphaFold3结构模拟显示10C11主要识别N端Ig样V-set（IgV）结构域内的经典配体结合位点，可能通过空间位阻干扰内源配体多价结合，而10E12靶向C端茎区附近非经典表位，可能稳定受体二聚体并锁定TREM2为高活性构象，从而协同激活SYK和AKT通路。研究结果支持TREM2激活在AD早期主要通过突触保护缓解认知损伤的假说，而非单纯依赖Aβ斑块清除。与既往临床失败案例（如AL002因CNS暴露不足、DNL919因脑暴露不足和剂量限制性副作用）相比，本研究通过vHPC局部给药提供了机制明确性，且单次静脉注射可达治疗阈值的脑浓度。通过工程化双特异性抗体偶联抗转铁蛋白受体1（TfR1）抗体有望进一步提升CNS递送效率，为非侵入性全身给药奠定基础。
综上所述，该研究聚焦于早期AD小鼠模型中TREM2激活抗体的神经保护机制，发现两种sdAb通过激活小胶质细胞、抑制Aβ生成、降低C1q介导的补体途径和挽救突触结构与功能，改善认知缺陷。其中突触保护是TREM2介导早期认知挽救的关键机制。研究局限性包括：抗体抑制APP淀粉样切割和C1q表达的确切分子通路仍需深入表征；10C11不依赖AKT和斑块清除的替代神经保护机制边界尚待明确；全身给药疗效尚未验证；需在雌性5×FAD小鼠中验证结果的普适性；通过C1q阻断直接干预补体通路将有助于明确补体信号在突触保护中的因果作用。未来将开发偶联BBB穿梭体的双特异性融合抗体，推动非侵入性高效临床应用。
