荧光原位杂交在临床诊断中应用与实验方法

光原位杂交在临床诊断中应用与实验方法

王怀军
上海市第一妇婴保健医院 上海市产前诊断中心

　　一．简介
    荧光原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization)是原位杂交技术大家族中的一员，因其所用探针被荧光物质标记（间接或直接）而得名，该方法在80年代末被发明，现已从实验室逐步进入临床诊断领域。基本原理是荧光标记的核酸探针在变性后与已变性的靶核酸在退火温度下复性；通过工业区光显微镜观察荧光信号可在不改变被分析对象（即维持其原位）的前提下对靶核酸进行分析。DNA荧光标记探针是其中最常用的一类核酸探针。利用此探针可对组织、细胞或染色体中的DNA进行染色体及基因水平的分析。在该领域中产品颇具名气的公司之一为美国Vysis公司，它是一家专业生产FISH产品的公司，其产品涉及到荧光标记探针，杂交，检测用试剂，杂交用仪器，观察分析用仪器用及软件等，几乎涵盖FISH技术所需的所有试剂和设备。
    荧光标记控针不对环境构成污染，灵敏度能得到保障，可进行多色观察分析，因而可同时使用多个探针，缩短因单个探针分开使用导致的周期过程和技术障碍。Vysis公司的荧光标记探针均为直接法标记，可省去信号放大系统，减少试剂投入且保障更大程度的特异性，同时也有信号清晰，背景低及方法简单易于操作等优点。
二．基本仪器与试剂
1． 仪器
    FISH技术所需仪器就档次讲可分为高档和低档两类，高档的可直接从Vysis/Apply Image(AI)公司购买低档的可自行配置，前者可直接向该公司垂询，后者将在下面列出。两者在实验稳定性上无多大差别，只要操作熟练可获得同等效果，但若使用该公司仪器可减少实验中的一些不方便简化实验过程。
离心机：一般国产的即可，主要用于试剂开盖前及混匀后离心
水浴缸（或锅）：用于水浴 维持试剂的温度
恒温培养箱：用于放置载片进行杂交
加样器与吸嘴：用于移取试剂
染缸：用于盛放变性液、脱水液、洗涤液等
载玻片：用于样品制备
盖玻片：用于复性液及钠染液封片
荧光显微镜（至少带两种滤片）
2． 试剂
荧光直接标记探针
杂交缓冲液 Vysis公司在提供探针的同时提供杂交缓冲液
甲酰胺：可购买后去离子，亦可直接从V ysis公司购买
NP-40
20*SSC：可以从公司购买成品，也可自行配制
负染液：有DAPI I，DAPI II，PI等，可直接从Vysis公司买
100%乙醇：用于脱水
12N HCl,1NnaOH用于调节溶液Ph
封片剂

三．实验过程
1． 试剂准备
20*SSC：称20*SSC 132g,溶于400ml纯水，用HCL调小号H至5.3.定容至500ml
2*SSC:取100ml 20*SSC，稀释10倍，用NaOH调至7.0±0.2
2*SSC/0.1% NP-40:
100ml 20*SSC(PH5.3)
850ml 纯水
1ml NP-40　　　　　　以NaOH调pH至7.0±0.2
变性液（70%甲酸胺/2*SSC）
49ml 甲酸胺
7ml 20*SSC(PH5.3)
14ml 纯水 配成70ml，室温测PH（7.8-8.0）,也可据染缸的大小增 加或减少用量，密封贮存于2-8度，7天后弃去
乙醇溶液：20%、85%、100%乙醇溶液
0． 4*SSC/0.3% NP-40洗涤液（用于迅速洗涤）
20ml 20*SSC
950ml 纯水
3ml NP-40 配成1升，NaOH调pH至7.0-7.5

2.实验流程
    具体应用时应根据本实验室条件及参考说明书进行预实验，等实验条件稳定后即可用于临床.Vysis公司在提供试剂时有详细试剂说明书可供参考，在此只列出大致流程
载片73±1 度的变复性液内变性5min
↓
70%,85%100%乙醇序列脱水各1min
↓
预制备探针混合物(按试剂说明书提供配方)
↓ 滴加于载片上
封片
↓
退火温度下(试剂说明书中有具体温度)杂交1-16小时
↓
载片于0.4*SSC/0.3%NP-40 73度洗涤约2mm
↓
2*SSC/0.1%NP-40洗涤5s-1min
↓
取出凉干载片
↓
加10μl负染液
↓
观察
四.FISH在临床诊断中的应用
    FISH在临床诊断中的应用中的范围很大,在此只列出运用最为广泛的例子,若有此方面问题亦可向该公司垂询.
1. 产前诊断-快速诊断
    产前诊断为优生优育的重大课题与每个人合运息息相关,染色体病和基因病诊断越来越成为医生和病人(孕妇)关注的焦点.就染色体病而言,其发病率高,但经典细胞遗传方法不能满足快速诊断及病例大量增加而待诊的需要,而荧光原位杂交可弥补上述不足.主要原因是FISH可对间期细胞染色体作遗传分析,对于采获的胎儿细胞(如羊水\绒毛\脐带血\皮肤细胞等)可不经培养即可提供准确的染色体信息,缩短周期,减少因培养失败而带来的负担.就人群中染色体发病而言,13,18,21,X,Y染色体数目异常占95%,因此如同时运用此五个探针,可排队95%的染色体病例,这种探针Vysis公司可提供通过FDA批准的试剂盒.当然对于开展了唐氏筛查的单位,也可单独运用21号染色体专一探针作出胎作是否为21三体综合的诊断.同样对于染色体水平的结构畸变.如缺失或重复,及基因水平的缺失或重复,利用FISH技术也可对间期细胞进行诊断.
2. 产前诊断-疑难染色体病例的确诊
    有些染色体畸复如易位,缺失和重复等往往在常规染色体分析中不能明确诊断,若运用FISH技术使用区域专一性控针或染色体涂染深针可很快地作出明确诊断.
3. 胚胎着床前诊断
    对于不孕症患者来说,昂贵的费用使得他们对来之不易的妊娠特别珍惜,因此在胚胎植入母体子宫这前有针对性地进行遗传病的诊断,可杜绝不良胚胎的植入,减少畸形胎儿发生率,为试管婴儿及其父母带来更大好处.但植入前胚胎能奉献出细胞用于遗传分析的数量有限(为1-2个细胞)且为间期细胞,因此唯有用FISH技术方能从染色体水平对胚胎进行诊断,当然也可从基因水平对某些基因病进行诊断.
4. 产后诊断
    对于大量产前遗漏的疑难染色体病或基因病,如染色体易位,重复和缺失等可在产前后通过FISH技术进行诊断,一方面可明确诊断,更重要的是为其后代产前诊断提供有力依据.
5. 肿瘤诊断
    肿瘤现已成为铖害人类健康的一大公害,几乎人的每一个器官都可能发生肿瘤,虽然肿瘤的种类够多,涉及到的器官也不大一致,但从发病机理角度看,不外乎基因水平和染色体水平.明确诊断是进行治疗,选择治疗方案及有效治疗的前提.Vysis公司可能提供一些肿瘤诊断的探针,包括基因水平的,也有染色体水平的.可使用的标本有新鲜的组织标本,石腊包埋的组织标本,细胞涂片(如外用血细胞),培养细胞(包括间期和中期细胞)等.

    总之FISH技术在临床诊断所能适用的范围极其广泛,在具体运用过程中应依不同病种选择相应探针,只有这样才能达到诊断明确,投入最低的效果.