植物抗体

植 物 抗 体

许金飞

1. 抗体的结构和功能
1.1. 抗体的分类 
    抗体就是免疫球蛋白。人的免疫球蛋白可分为五类，及分子量范围从150KD到950KD免疫球蛋白M（IgM）是对一个抗原作出反应时产生的第一个抗体。免疫球蛋白G（IgG）是一类最简单的免疫球蛋白。IgG含有两条相同的高分子的重链（heavy chain）和两条相同的低分子量轻链（light chain ）。四条链通过二硫键共价连接成Y字形结构。每一免疫球蛋白分子含有二个抗原结合部位，它们位于Y字形结构的两个顶点。如果抗原含有两个或两个以上的抗原决定簇（antigenic determinant）那么抗体可以形成一个抗体－抗原分子的交链晶（cross-linked）而沉淀。抗原决定簇就是抗原分子中决定抗原特异性并能与和它互补的抗体结合部位结合的那部分结构。抗体是二价的，而抗原可以是多价的。但抗体与抗原等价存在时，将发生最大的交联。产生最大的免疫沉淀（immunoprecipitate）或称沉淀素（precipitin）.免疫球蛋白的轻链可以分为k（kappa）l（Lambda）两大类。所有五种类型的免疫球蛋白都以含k或l的两种形式存在。重链可以分为五大类，g、a、m、d和e。每一种类型的免疫球蛋白只含有其中的一类重链，G、A、M、D和E五类免疫球蛋白分别含有g、a、m、d和e。免疫球蛋白的A和M的分子量较大，这是由于链增多的缘故。这两类免疫球蛋白的功能尚未确切了解。免疫球蛋白A是分泌液（眼泪、粘液和唾液）中存在的一类主要抗体，并且是抵御入侵的细菌和病毒的第一道防线。免疫球蛋白D和E特有功能还不清楚。

1.2 免疫球蛋白的一级结构
    免疫球蛋白G的轻链和重链的一级结构可以划分许多结构域，这些结构域根据它们的顺序同源分类。每种免疫球蛋白的轻链都含有可变区（variable region）和恒定区（constant region）。可变区内（V1）内不同抗体之间氨基酸顺序是可变的，恒定区（CL）内抗体之间的氨基酸顺序近乎不变。同样，重链也含有可变区和恒定区，标为VH、CH1、CH2和CH3。在可变区内有所谓高变区（hyper variable region）,近乎所有的顺序变化都发生在此区域内。可变区剩余的顺序比较恒定，这颗粒是形成免疫球蛋白的基本结构单位所要求的。 VH链的高变区与VL链的高变区一起提供氨基酸残基以形成抗原－抗体结合部位，每种抗体的特异性决定于轻链和种链的高变区内的氨基酸顺序。种链的CH1和CH2区通过一个“铰链区”（长约30个氨基酸残基）连接。但用木瓜蛋白酶处理时，在“铰链区”可发生 断裂，生成Fab。用胃蛋白酶处理产生F（ab’）2片段。Fab片段仍然与抗原结合表明轻链是抗原结合的部位。

    抗体的恒定区（CL，CH1，CH2和CH3）之间有不少同源序列。轻链和重链的可靠叶柄有趣同源序列。一级结构的每一结构域，不论是恒定区还是可变区在自己的辖去都含有一个二硫键。另外还有四个二硫键是用于连接四个肽链使成一体。上面这些相似性表明了有一个原始基因经过几次连续复制形成了现在的抗体。

1.3. 免疫球蛋白的三级结构
    免疫球蛋白的三级结构的最主要特点是所谓免疫球蛋白的折叠(im-munoglobulin fold),它是由二b－折叠片夹着疏水残基内核而形成的一种结构式样。b－折叠片约涉及“免疫球蛋白折叠”的半数残基。由 一个二硫键把二个b－折叠片维系在一起。在b－折叠片的这些氨基酸是很保守的。顺序的变化主要发生在连接b－折叠片的环上。在更加复杂的结构中，如在小鼠的骨髓瘤的免疫球蛋白G的Fab片段中，只是重复出现“免疫球蛋白折叠”的结构（如果免疫系统的一个细胞发生癌变，细胞将发生失控的复制，形成骨髓瘤，有骨髓瘤产生的免疫球蛋白G人结构可以 大量地存在，甚至使血液变稠）。骨髓瘤IgG的结构可分成含有V和VL链的可变区和含有CL和CH1结构域的恒定区。连接可变区和恒定区的这股短的多肽链被称为开关区（switch region）。轻链和重链的高变区顺序是在彼此紧密接触的表面上。抗原的结合发生在可变区轻链和重链高变区的袋穴中。

2. 植物表达的抗体分子
    Hiatt, A.C. et a l989 年[1]首次报道利用转基因植物表达抗体。从表达能与磷酸酯（P3）结合的IgG1抗体的鼠杂交瘤的mRNA中获得cDNA，与植物表达载体pMON530构建成重组子，用叶盘转化法转化烟草，再生得成熟植株。表达了单一g-chain 和k-chain的植株进行有性杂交产生子代。同时表达了两条链的子代，其体内组装出了有功能的抗体。g-chain和k-chain含有信号肽的全长cDNA转化的植株其有功能抗体的蛋白占叶片总蛋白的1.3%，而不含有信号肽的cDNA转化的植株，其有功能的抗体含量比前者少。从转基因植物得到的重组抗体与从杂交瘤来源的抗体一样，能识别抗原（P3）的专一位点。他们的工作阐明了这样的原理：在植物体内，两个重组基因产物能够正确折叠、组装成异二聚体抗体，它与脊椎动物来源的异二聚体抗体有相同的功能。于是，许多课题组都竞相把其它抗体分子用植物来表达，这些既有单链的抗体分子，也有多聚的分泌型抗体。

    Benvenuto E. et al 1991[2]年报道了重链可变区（VH）在转基因烟草的表达。将编码VH结构域的基因序列克隆至载体pBI121.1的PstI-BstII位点之间，经农杆菌介导的方法转化烟草，VH结构域在烟草里得到了整合.表达，其表达量约占可溶性蛋白的1%。

    Duing K. et al 1990年[3]报道了IgM（lambda）在转基因烟草的表达。用大麦a-淀粉酶的信号肽序列分别和编码成熟单克隆抗体重链、轻链的cDNA构建成重组基因。两个重组基因克隆至表达载体pSR4-3，经农杆菌介导转化烟草。重链和轻链均得到了表达。一部分重组抗体停留在内质网，但一大部分重组抗体则被转移到叶绿体。用亲和层析法表明，在细胞内产生的重组抗体具有生物活性。

     Firek S et al 1993年[4]报道了Single chain Fv 在转基因烟草的表达。合成PR1a-AS32-SCFv融合基因，将其克隆至pROK2载体的表达框，经农杆菌介导转化烟草，用免疫印迹法计算出ScFv蛋白占可溶性蛋白的0.5%，且极大部分有抗原结合活性。用转化细胞悬浮培养进行表达，ScFv被分泌到培养介质中，很容易分离、纯化。用含有引导ScFv到质外体的PR1a信号序列的ScFv转化的烟草比不含信号序列的ScFv转化的烟草蛋白表达量要高。

    Van Engelen et al 1994 年[5]报道了IgG（kappa）在烟草的根中表达。其研究目的是探索利用抗体获得抗性的可能性。他们所用的基因为抗真菌角质酶单克隆抗体基因。通过PCR扩增得到轻链、重链，用串联和分散两种方式融合CaMV35S和TR2’启动子后转化烟草的根，两种重组子均得到了表达和重组，

    Ma JKC et al 1995年[6]第一次描述了用转基因烟草表达有功能的高分子量、分泌型的免疫球蛋白。他们先得到分泌型抗体四个成分的基因：重链和轻链基因、链接链和分泌成分（SC）基因，然后将其导入不同的烟草植株，把表达了单个抗体成分的植株进行有些性交，筛选共表达了各种成分的子代，发现一些子代中产生了有功能的分泌型抗体，这种植物重组抗体能够识别Streptococcus mutans 和Strertoco的表面粘链分子SAI/II。从完全展开的叶片中获得的抗体产量为200－500ug/g.fr.w.。但是到目前为止，复合的分泌型单克隆抗体只能通过极其复杂的技术才能获得，列如上皮细胞来源的分泌成分对脊椎动物浆细胞分泌的二聚免疫球蛋白进行体外连接。大规模的农业化生产这种分泌型抗体对需要大量单克隆抗体的粘液表面被动免疫治疗有很重要的经济意义。 

3. 植物抗体的组装和加工
    与其它重组表达系统相比，植物作为表达系统来表达抗体最突出的优点是：能有效的组装轻链和全长重链，形成完整的抗体分子。细菌表达系统很难组装出完整的抗体分子，例如要用大肠杆菌表达出二价抗体分子需经过复杂的分子工程[7]。大多数情况下，小的抗体分子，如Fab或ScFv，不能有效行使保护作用；虽然免疫球蛋白的不变区在抗原的识别和结合时不发挥作用，但它有重要的效应子功能，并且含有几个重要抗原决定部位，这包括糖基化作用、补体活性、结合吞噬细胞；交链区、与J-chain结合的位点和分泌成分。 它也允许二价抗原在交链区与抗体可逆的结合，这在保护作用时是非常重要的。

    目前，已经有报道完整的抗体分子在植物内的表达[1][3][6]。由于单一的轻链、重链和错误组装的抗体分子是没有功能的，所以抗原的识别和结合特性是检测抗体是否正确组装的重要的、灵敏的方法。人们已经部分弄清了脊椎动物浆细胞的抗体组装机制：免疫球蛋白的轻链和重链在合成时含有信号肽，信号肽把翻译指引到内质网（ER），在内质网腔内信号肽被水解；内质网腔内至少有两个蛋白BiP/GRP78和GRP94充当分子伴侣，以协助抗体的折叠和组装[8][9]。

    在植物体内，抗体的组装和折叠也必须经过内质网，这非常相似脊椎动物浆细胞的抗体加工机制。当缺少与重链或轻链相关的信号肽时，抗体分子不能有效组装[1]，但是许多来源的信号序列包括植物的和非植物的均能发挥作用[1][3][10]，并在植物的ER内被水解。植物ER腔中的分子伴侣相似于脊椎动物的BiP和GRP94[11][12][13]，至于它们怎样协助外源蛋白组装尚未完全弄清。当抗体分子组装成完整的四聚体时，积累的蛋白量也随之增加，这表明抗体分子的天然构象对维持它的稳定性是非常重要的[1]。

    与脊椎动物免疫球蛋白和免疫相关蛋白一样，植物抗体也被糖基化。对植物抗体糖链的分析是通过比较抗体和鼠源抗体的差异而展开的，一个基本的方法是通过与凝集素的结合进行分析[10]。已有试验表明：植物、动物以及其它生物在糖链上有一个共同的特点：N－型糖链的核心部位高甘露糖[14][15][16]，植物抗体的糖基也具有这样的特点。但在复杂的糖链上，植物抗体和脊椎动物抗体是不同的，复杂的植物糖链是异源的，它们通常比脊椎动物的糖链小， 并且末端糖残基也不一样。

    植物抗体糖基化模式的不同并没有影响它的抗原结合性、专一性，但用作治疗时，植物特性的糖链可能会提高植物抗体的免疫 原性，所以在实践应用前，必须除掉其复杂的糖链，或者改变重链序列以除去N－型糖基化位点，另外一种可行的方法是用缺少糖基化所需酶的突变植株来表达抗体[17]。

    与脊椎动物细胞一样，在组装和翻译后加工后，抗体被植物细胞分泌[10]。植物抗体被分泌到胞外对防止降解是有利的，由于胞外含有更少的蛋白水解酶，是一个更加稳定的环境。如果ScFv被分泌到胞外，而不是停留在胞质内，其积累的蛋白量会更高[4]。另外抗体分泌到胞外更易于分离、纯化。

4. 植物抗体工程
    抗体分子的结构特点使它能够很方便的进行分子工程。我们不仅可以设计各种抗体片段、单链抗体分子，而且也可以对完整的抗体分子进行操作。

4.1. 抗体片段
    多种抗体片段都已经得到了重组表达，如：FV. Single Chain and single domain[18][19][20]. 这些抗体分子结构简单，组装的要求不高，它们能够在大肠杆菌或其它异源表达系统中产生。这些小的抗体分子：一方面，在某些应用领域是有利的，另一方面，它们的抗原亲和性，不能刺激二级免疫反应。由于通过内质网（ER）的加工不是必须的，所以抗体片段能够在细胞内积累，如有必要，可用信号序列将其引导至胞外，如前面所述，在大肠杆菌里表达的大多数抗体片段也能用植物来表达获得，如：在烟草中表达的单结构域抗体（dAb）[2]、ScFv[21][22]分子，拟南芥和烟草中表达的Fab[23]等，但是它们也能在其它表达系统中迅速地、高效地表达，所以用植物来表达小的抗体分子作为免疫治疗似乎不是一个明智的选择。但是，在植物里表达的抗体对病原菌具有抗性是有意义的。

4.2. 全长抗体
    植物能够产生完整抗体和组装脊椎动物来源的蛋白。这 被用来表达Fc特性发生改变的抗体分子，列如，改变IgG抗体重链C－端结构：Cg2和Cg3结构分别被IgA抗体的Ca2和Ca3结构替换植物仍然能够组装出有功能的抗体分子[6]，这些改变并没有影响抗体的抗原结合性和专一性，但这改变了通过Fc介导的抗体保护功能。免疫球蛋白分子不变区的数量也可发生改变。列如，重组抗体IgA-G重链由Var-Cg1-Cg2-Ca2-Ca3结构域构建，这种重组增加了一个结构域，不影响重链和轻的相互作用，也不影响其对抗原的识别，但这种植物工程抗体具备了IgG和IgA两个分子的功能：Cg2结构域结合补体、嗜中性白细胞、葡萄球菌、ProteinA，Ca3结构含有J-chain结合位点和分泌成分。

4.3. 多聚抗体
    植物表达抗体的最初策略是：不同植株表达不同的免疫球蛋白链，通过有性杂交，把重链和轻链引导至同一子代植株，产生一个表达抗体的植株至少需要两代[18,23]。用这种方法获得的重组抗体的产量相当高，占植物总蛋白的1～5％。为了把重链和轻链同时导入同一植物细胞，有人用两次转化的方法[23]，也有人把重链和轻链基因克隆到一个T－DNA区域内，再转化植物细胞[2][3]。

    通过连续有性杂交的方法，转基因植物能够累积基因，这是获得多聚体蛋白的一个有效途径，用这种方法时，为了增加一个植物细胞同时表达单体的可性，使用相同或相似的启动子是重要的[24], 应用的最为广泛的启动子是烟草花叶病毒来源的CaM35S。分泌型抗体（SIg－A）是一个典型的在植物内组装的多聚体蛋白。

    SIgA是在粘液处最主要的抗体形式。由于SIgA是复杂的多聚体蛋白分子，生产单克隆SIgA是相当困难的。SIgA的两个基本单元是重链和轻链，它们通过连结链（J-chain）连结成二聚体，再进一步与四个多肽、分泌成分（SC）结合。SIgA的这些修饰能够增加SIgA在粘液环境中的活性通过J-chain二聚化提高了抗体的抗原亲和性和细胞聚合的能力，分泌成分能防止抗体的蛋白水解，这种能力在恶劣的粘液环境中（如肠胃道）是很重要的，在脊椎动物中，SIgA的组装要求有两个细胞，一个浆细胞产生基本单元、J-chain和分泌二聚体IgA（dIgA）；另一个是上皮细胞表达分泌成分的前体分子，通常，分泌成分前体在上皮嗜碱表面结合dIgA，激发一个内吞、转移、裂解的过程，最终导致SIgA复合体分泌[25]。而单价Fab没有保护作用，这说明聚集沉淀可能是重要的抗体保护机制。

    四个被转化、再生的烟草植株分别表达SIgA的四个成分：鼠单克隆抗体k-chain、杂交IgA-G抗体重链，鼠源J-chain、兔源SC。将表达了单一成分的转基因植株进行连续的有性杂交，以产生四条链同时表达的植株。在最后组装了四联体抗体的植株中，抗体的三中形式都被检测到。样品的Western blot 分析显示了相应的免疫球蛋白条带：Mr210Kr是但体IgA-G的预期大小，Mr400K是J-chain连接的二聚IgA-G，Mr470K是连接有SC成分的二聚IgA－G。这种组装是非常有效的，多于50％的SC同二聚IgA-G连接。从完全伸展的叶片分析到的SIgA-G的产量是200－500mg/g.fr.w。功能研究也确证了SIgA-G分子能与它相应的抗原结合。这些结果均表明了植物完全能够表达、组装复杂的脊椎动物多聚体蛋白。与动物至少要两个细胞才能产生分泌性抗体相比，植物组装分泌抗体在一个细胞内就能完成。

4.4. 植物抗体的免疫治疗前景
    抗体的巨大的治疗前景，一直都受到人们的重视。但直到1996年底为止，被美国FDA批准应用于治疗的抗体仅只有3个。这表明发展治疗性的单克隆抗体还存在许多问题。植物抗体为抗体工程开辟了一个新的途径，它不仅能够帮助克服发 展免疫治疗抗体的问题，也有望用极低的费用大量生产抗体分子。获得大量抗体分子是开展免疫治疗的前提，植物抗体在粘液位点的被动免疫有很诱人的前景。

    抗细菌Streptococcus mutans表面粘连分子的IgGmAb被应用于非人类动物的口腔，阻止了这种细菌在口腔的着床，也降低了这种微生物所导致的疾病的水平。mAb被直接应用到人的牙床时能够长期抵抗S. mutans的着床。在这些研究中，仅只有二价的抗体形式F(ab’)2或IgG具有保护作用，而单价的Fab没有保护作用，这说明聚集沉淀是重要的抗体保护机制。

    但是，在粘液处起主要作用的不是IgG，而是SIgA。这是由于SIgA的复杂结构决定的：一方面，能够多价的结合抗原和有效的发生聚集沉淀，从而增加了与抗原的亲和性；另一方面，能防止蛋白水解酶的降解。但由于获得SIgA相当困难和主动免疫的SIgA效应持续时间长,所以很长一段时间以来SIgA在粘液处的保护作用一直被忽视了。解决这一困难的方法是单克隆抗体SIgA作被动免疫。因此获得大量的专一的单克隆抗体是必须的，然而SIgA的复杂结构和组装的困难，生产SIgA很难，但转基因植物是一种很有潜力的生产SIgA的方法。

    植物抗体的另外一种前途是用可食植物表达治疗抗体，或者把抗体指引到种子、块茎或果实中表达作口服之用。用可食植物表达有功能的抗体可以减少甚至免去抗体的纯化过程。抗体通过可食植物分配到口腔是非常成功的。近来也有实验表明：植物重组抗体能够通过植物输送到肠胃道而诱导免疫应答。

5. 植物体内目的的抗体表达
    抗体的植物表达除了作为体外目的外，抗体在植物体内的行为也成为一个重要的研究领域。尽管植物缺少脊椎动物所具有的抗原激发的抗体诱导机制，但抗体的结合能力能沉聚病原菌，从而阻止病原物的感染。表达了一个停留在胞内的的抗artichoke mottled crmlue virus 衣壳蛋白抗原的SCFV的烟草对这种病毒敏感性明显降低。用转基因烟草表达了一个含有重链和轻链的全长抗体，这个抗体是抗TMV表面抗原，且含有一个分泌到胞外的信号肽，它使转基因植物具有抗TMV的能力。最近，植物体内目的的抗体研究主要集中在root-knot 线虫（Meloidogyne incognita）。对进行瞬时表达的烟草叶片胞质分析表明：很高的胞内有功能的ScFV（单克隆抗体6D4）的积累阻止了这种线虫的唾液分泌（这在线虫的感染过程中起重要作用），在6D4的有功能的含有重链和轻链全长抗体表达后，在烟草（Nicotiana tabacumcv Xanthi）叶、茎、根内没有观察到对线虫的影响。一种可能的解释是：植物抗体是非胞质积累，而线虫分泌的唾液被 注射到被感染细胞的胞质内。

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