Pyrosequencing工作原理[创新技巧]

    Pyrosequencing是对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量的、精确和重复性好的分析的技术。

第一步——测序引物和PCR扩增的、单链的DNA模板杂交，与酶—DNA聚合酶（DNA polymerase）、ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase）、荧光素酶（luciferase）、三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）—和底物—adenosine 5´ phosphosulfate (APS)、荧光素（luciferin）孵育。

第二步——四种dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模扳配对（A—T，C—G），此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。

注意：反应时deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATPS)是dATP的替代物，因为DNA聚合酶对dATPS的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATPS不是荧光素酶的底物。

第三步——ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素（oxyluciferin）的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。
         ATP sulfurylase
PPi+APS —————————> ATP

            Luciferase，ATP
Luciferin —————————> oxyluciferin

   

    光信号由CCD摄像机检测并由软件pyrogram™反应为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。

第四步——ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。

第五步——然后加入下一种dNTP。

    在以上步骤循环进行中，互补DNA链合成，序列从pyrogram™的信号峰中决定。

    利用PSQ96系统进行测序分析可期望得到20-30个碱基的读序长度，但是和任何测序技术一样，最大读序长度取决于模板的二级结构、碱基组成、PCR产物质量和其他参数。

最佳化的Pyrosequencing
    Pyrosequencing反应利用的是酶级连系统，简单且强有力，给出阳性或阴性结果，每种成份和参数已最佳化，以得到高度一致的结果，精确度为99%。
* 底物浓度已最佳化
* 选择了Apyrase的特异浓度，保证了所有的dNTP被降解，包括ATP和dATPS
* dNTP降解速率慢于掺入速率，有利于dNTP充分掺入
* ATP合成速率快于ATP水解速率，使的ATP浓度和光产生正比于掺入的dNTP
数目
* 仔细控制的试剂，保证了足够的活性和质量

待测序模扳制备
    通过PCR技术将待测序列扩增，其中引物之一在合成时用生物素标记。加入STREPTAVIDIN包被的磁珠于扩增的DNA中，DNA分子通过引物的生物素和STREPTAVIDIN包被的磁珠形成复合体。DNA变性后，带生物素标记引物的单链在磁场中得到纯化，然后就可用于与测序引物退火，以便进行测序反应。


PSQ 96系统系统工作流程
1, 基因组DNA提取
2, 设计和合成PCR引物，其中之一标记生物素; PCR反应
3，DNA双链的分离，含生物素的单链DNA与测序引物的退火
4，对含生物素的单链DNA的测序/基于测序的SNP分析及等位基因频率确定

PSQ96系统包含了进行上述工作（3-4）的仪器及配件、软件、试剂，系统的设计满足高通量、快速、精确和经济的要求。

　

系统定购信息（进行SNP analysis, allele frequency determination 和sequence analysis等工作的系统）

System and softwares
PSQ 96 System/SNP/AQ/SQA (220-240V) Code No: 60-0085

SNP Reagent Kit（进行SNP分析的KIT）
Kits contain all components needed for SNP analysis:
●Enzyme mixture (DNA polymerase, ATP-sulfurylase, luciferase, apyrase)
●Substrate mixture (luciferin, adenosine 5’ phosphosulfate)
●Nucleotides (dATPS, dCTP, dGTP, dTTP)
●Reagent cartridge

PSQ 96 SNP Reagent Kit 5x96
- perform up to 480 SNP analyses Code No: 40-0005
PSQ 96 SNP Reagent Kit 1x96
- perform up to 96 SNP analyses, includes 1 x 96-well plate. Code No: 40-0001

SQA Reagent Kits(进行序列分析的KIT)
Kits contain all components needed for sequence analysis, optimized to allow for the number of nucleotide dispensations required when analyzing a gene-specific sequence.
●Enzyme mixture (DNA polymerase, ATP-sulfurylase, luciferase, apyrase)
●Substrate mixture (luciferin, adenosine 5’ phosphosulfate)
●Nucleotides (dATPS, dCTP, dGTP, dTTP)

PSQ 96 SQA Reagent Kit
- perform up to 96 SQA analyses Code No: 40-0006