发夹核酶的研究与应用

«生命的化学»2001年21卷1期

姚  杰  杨克恭  陈松森
(中国医学科学院基础医学研究所、中国协和医科大学基础医学院，北京  100005)

关键词：发夹核酶；催化机制；基因治疗

中图分类号：Q556⁺.5

    核酶(ribozyme)是既能特异识别又能特异切割小分子RNA的核酸内切酶，其本身也是RNA，主要包括发夹核酶、锤头核酶、丁肝病毒、链孢霉属VS和铅依赖性RNA，共同特点是可逆地切割底物RNA的磷酸二酯键，生成5'-OH和2'，3'-环磷酸末端。虽然催化产物相似，但它们的结构和催化机制却是很不相同的。

    发夹核酶(hairpin ribozyme)发现于三种不同植物RNA病毒，即烟草环点病毒(tobacco ringspot virus)，菊苣黄色斑点病毒型(chicory yellowmottle virus type)和筷子芥花叶病毒(arabis mosaic virus)。三种发夹核酶分别是这些RNA病毒卫生RNA(satellite RNA)的负链，它们的英文缩写分别是sTRSV、sCYMVT和sARMV，均为单链RNA，以滚环方式复制^[1,2]。目前针对AIDS而人工合成的发夹核酶已成为第一个进入基因治疗临床试验阶段的核酶。

1.  结构

    当发夹核酶与底物结合时，基合物二级结构包括5个环和4个螺旋(图1)。核酶和底物组成螺旋1、2及对称的环1、5。4个螺旋包括18个碱基对，只有一个非正规碱基对A·G。发夹核酶分别为2个结构域，结构域I由螺旋1、2和环1、5组成，结构域II由螺旋3、4和环2、3、4组成。腺苷酸残基A15连接两个结构域，使它们相互靠近相互作用，形成催化反应所必需的三级结构。环3被认为与催化作用无关^[3]。

图1  天然发夹核酶-底物模型
天然发夹核酶-底物复合物含有4个螺旋区和5个非螺旋区(环)，形成两个结构域，A₁₅将这两个结构域分开。底物链碱基编号前加s(s1~s14)。

2.  催化机制

    发夹核酶通过反式转酯反应于环5的A₅₅和G_S6之间切割底物，产生5'-OH和2'，3'-环磷酸末端。反应中磷原子周围构型发生倒位，提示反应为成线机制。发夹核酶可顺式切割，也可反式切割，顺式切割比反式切割快，单个分子切割速率约为1.0/min。连接反应为切割反应的逆反应。sTRSV的反式切割遵循米氏公式，K_M值为19~96 nmol/L，K_cat在0.12~0.36/min间，反应最适温度为37ºC，活化能为19 J/mol。发夹核酶催化的反应比较特殊，其底物分离速率比切割速率慢许多，而连接速率为切割速率的10倍。

    RNase A的转酯反应质子化与去质子需要2个组氨酸残基，但是发夹核酶不含组氨酸，那么接受2'-OH质子的一般碱和供给5'-O质子的一般酸是什么呢?Siwkowski等发现发夹核酶-底物复合物中有6个碱基为催化反应所必需，即G8、A22、A23、C25、A38和G_S6，前5个来自核酶，后一个来自底物^[4]。Shippy等也证实，在六氨合钴III(惰性的Mg²⁺六水合物类似物)缓冲液中，G8、A22、A23、C25和A38可使发夹核酶恢复部分活性。Farnsworth等证实同时将A22变为C，A23变为U，C25变为A，发夹核酶仍有部分活性。上述结果提示，前5个碱基不直接参与催化反应，而可能起结构性作用。底物G_S6上N1、N7的pKa分别为9.5和2.4，在适当条件下它们可以作为反应的一般碱和一般酸。但G_S6在催化过程中的确切作用尚不清楚。发夹核酶催化的切割反应可能是一般酸碱催化，但反应中确切的一般酸和一般碱是什么，尚有待进一步证实^[5]。

    一般而言，金属离子在核酶催化反应中有两种作用：结构性作用及催化作用。2价金属阳离子的存在与结合，使发夹核酶局部构象发生改变，这也许是切割反应发生的先决条件。例如，2个镁离子分别结合发夹核酶，一个位于两个结构域的连接处，另一个位于环与环作用的交界面。它们相互协同，诱导发夹核酶折叠。以下三个方面的实验也证实2价金属阳离子(如游离的镁离子)的存在可能只与过渡态的形成有关，而与催化活性无关：(1)镁离子催化的切割反应并没有产生更多的硫代同分异构体(切割反应的中间底物之一)。(2)惰性的Mg²⁺的六水合类似物----六氨合钴III可替代镁离子进行切割反应。(3)pKa不同的水合金属阳离子(如：Mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺)存在时，发夹核酶的切割速率相同^[5]。另外，在没有金属离子而只有多胺及氨基糖苷类抗生素时，切割反应也可有效进行。因此，金属离子在发夹核酶催化的反应中只起结构性作用，而非催化作用。这一点与锤头核酶(hammerhead ribozyme)有着本质的区别。

3.  应用

3.1  发夹核酶作为基因治疗方法的优越性

    与传统基因治疗方法相比，发夹核酶具有更大的优越性。与通过同源重组获得突变基因(基因剔除)的方法相比，发夹核酶可以在适当的启动子调控下表达，以研究基因在个体不同发育阶段和组织中的功能。而基因剔除抑制基因表达缺乏时空性，且耗时。与三螺旋DNA相比，发夹核酶可选择性地抑制任何基因的转录，不受结构上的限制。而三螺旋DNA需要有一段寡聚核苷酸与DNA大沟结合，形成Hoogsteen或反Hoogsteen氢键，这就是要求双螺旋DNA的一条链富含鸟嘌呤，胞嘧啶要质子化。与细胞内抗体的方法相比，发夹核酶的切割反应局限在核内，不会引起免疫反应。而抗原与抗体的结合可发生在细胞内的任何地方，并可引起免疫反应^[6]。

3.2  人工合成的发夹核酶

    发夹核酶催化的反式切割星期三指核酶RNA与底物RNA分子不同。底物(环5)含有序列BN*GUC,*为切割位点，B可为G、U、C，N为任意核苷酸。螺旋2一般含4个碱基对，螺旋1一般含5~10个，大多数情况为8个碱基对^[7]。另外，用茎环结构GGAC(UUCG)GUCC替代环3的GUU，可增加发夹核酶的催化活性15倍。因为这种茎环结构比较稳定，可防止热变性和非活性构象的出现(图2)。
    Lian等研究发现sCYMV1、sARMV发夹核酶与sTRSV发夹核酶也稍有区别^[8]。

表1  几种发夹核酶的结构与切割位点序列的比较

发夹核酶	螺旋1(bp)	螺旋2(bp)	*G切割位点的序列
sCYMV1	5	4	*GUA
sATMV	5	3	*GUA
sTRSV	6	4	*GUC

图2  人工合成的发夹核酶
人工合成的发夹核酶可用于切割不同的靶RNA。螺旋1和螺旋2通过碱基配对同底物结合。螺旋2固定为4bp，而螺旋1的长度可变。碱基B可以是U、G或C，但不能是A；与之对应的V可以是A、C或G。右下图为取代环3-螺旋4部分的结构，可能增加催加催化活性。

3.3  发夹核酶转入细胞的方法

    发夹核酶DNA克隆于病毒或质粒载体，转导或转染细胞并在细胞中表达。这一途径主要受转导或转染效率和细胞中发夹核酶表达水平的影响。发夹核酶的表达水平由启动子的强弱和DNA转录的稳定性决定。转导或转染率除与细胞本身有关外，还与载体的性质有关。几种常见的病毒载体的特点如下。逆转录病毒载体转导效率高，外源基因可稳定地整合于宿主细胞基因组中。腺病毒载体只能瞬时表达外源基因，并生成抗体，产生强烈的免疫反应，转染的细胞迅速被清除，重复性差。腺病毒相关病毒载体转染细胞后无致病性，不裂解细胞，并可特异整合于宿主细胞基因组19号染色体上。

    发夹核酶(RNA)也可直接转染细胞。但是，细胞培养基富含的RNA酶将降解发夹核酶。又因为RNA酶切割磷酸二酯键需要核糖上的2'-OH，所以去除发夹核酶中核糖上的2'-OH可避免其被降解。用氟原子、氨基、丙烯基、O-甲基等替代2'-OH，核酶的半衰期可以从几分钟延长到几天^[9]。另外，通过脂质体表面阳离子与核酶表面阴离子的相互作用，在核酶表面形成一层保护膜。转染细胞时，脂质体可保护核酶不受RNA酶的降解。但细胞对脂质体的摄取以及核酶在细胞内的释放是这一方法的两个影响因素^[10]。

3.4  抑制HIV-1的基因表达

    发夹核酶可以用于AIDS等RNA病毒性疾病的治疗。RNA病毒突变率高，传统的治疗方法难以应付如此善变的病毒，而发夹核酶的应用就使问题迎刃而解。因为病毒基因组的启动子、剪接信号和包装信号的序列是相对保守的，发夹核酶可选择性地特异切割这些序列，抑制病毒基因转录、剪接和包装。它只作用于靶mRNA，细胞的生长及细胞本身DNA的合成并未因此受到影响。发夹核酶对人细胞的无毒害性使其成为基因治疗的有力工具。

    为治疗AIDS而设计的发夹核酶靶序列主要集中在HIV-1的5'前导序列和pol基因的编码序列。因为5'前导序列包含5'帽子和TAR序列，存在于所有HIV-1的转录产物及病毒基因组RNA中。在HIV-1的序列中，此段序列保守性高达85%。没有帽子结构的mRNA将易于降解，转录活性低。Qjwang等以HIV-1 HXB2克隆株第561~576核苷酸间的序列UGCCG*GUCUGUUGUGU为靶序列，于转录起始位点后第111~112核苷酸间切割[11]。以这一序列为靶序列的发夹核酶螺旋1含8 bp,K_M = 100 nmol/L,K_cat = 1.6/min,而天然发夹核酶的K_M = 30 nmol/L,K_cat = 2.1/min，可见这一发夹核酶具有天然核酶20%的催化活性。克隆了这一核酶的质粒与HIV-1前病毒DNA共转染HeLa细胞后，HIV-1 p24抗原表达减少，Tat活性下降。1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用这一发夹核酶抑制HIV-1基因表达，并率先进入临床I期^[12]。他们将AIDS病人T淋巴细胞分离出来，于体外用克隆了发夹核酶的载体转染这些细胞，然后再将这些细胞回输给病人。结果，病人体内HIV-1病毒蛋白复制减少，病毒滴度降低。

    HIV-1 pol基因编码区高度保守。因此，Yu等以HIV-1 HXB2克隆株第2490~2504核苷酸间序列CACCU*GUCAACAUAA为靶序列，于第2494~2495核苷酸间切割^[13]。以这一序列为靶序列的发夹核酶螺旋1含7bp，K_cat/K_M = 75 μ(mol/L)^-1min^-1，催化活性比以5'前导序列为靶序列的发夹核酶高5倍，比天然的sTRSV高7%。

4.  前景与展望

    发夹核酶除抑制HIV-1基因表达外，还可抑制乙肝病毒基因表达。Welch设计的发夹核酶克隆于逆转录病肝细胞后，83%的乙肝病毒复制受到抑制，同时乙肝病毒表面抗原，聚合酶和X抗原的表达也相应降低^[14]。

    锤头核酶在基因治疗方面的研究虽已涉及乙肝病毒、丙肝病毒、A型流感病毒、鼠肝炎病毒、乳头瘤病毒、肿瘤及显性遗传病等，但是因为金属离子在发夹核酶催化反应中的作用以结构性作用为主，所以在低镁离子浓度时发夹核酶就可达到最大催化效率，而这一镁离子浓度正与生理条件相符，所以发夹核酶在人类疾病的基因治疗方面具有广阔的前景。

参考文献

[1]   Haseloff J et al. Gene,1989,82:43-52
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