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SNP分析的新曙光[创新技巧]
【字体: 大 中 小 】 时间:2001年07月12日 来源:
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SNP分析的新曙光
这是一种新仪器,她基于一种新技术。在现在和未来,她将给DNA分析带来新的曙光。
Pyrosequencing的原理
Pyrosequencing是精确和稳定地对大量的短到中等长度的DNA序列样品进行分析的技术。
第一步,测序引物和PCR扩增的、单链的DNA模板杂交,与酶—DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP sulfurylase、luciferase、apyrase—和底物—adenosine 5´ phosphosulfate (APS) 、luciferin孵育。
第二步,四种dNTP(dATP,dTTP,dCTP,dGTP)之一被加入反应体系,如与模扳配对(A—T,C—G),此dNTP与引物的末端形成共价键,dNTP的焦磷酸基团(PPi)释放出来。注意:反应时deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATPS)是 deoxyadenosine triphosphate (dATP)的替代物,因为DNA聚合酶对dATPS的催化效率比对dATP的催化效率高,且dATPS不是luciferase的底物。
第三步,ATP sulfurylase在adenosine 5´ phosphosulfate存在的情况下催化PPi形成ATP,ATP驱动luciferase介导的Luciferin向oxyluciferin的转化,oxyluciferin发出与ATP量成正比的可见光信号。
ATP sulfurylase
PPi+APS —————————> ATP
Luciferase,ATP
Luciferin —————————> oxyluciferin
光信号由CCD摄像机检测并由pyrogram™反应为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。
第四步,ATP和未掺入的dNTP由Apyrase降解,淬灭光信号,并再生反应体系。
第五步,然后加入下一种dNTP。
在以上步骤循环进行中,互补DNA链合成,序列从pyrogram的信号峰中决定。
利用PSQ96系统进行测序分析可期望得到20-30个碱基的读序长度,但是和任何测序技术一样,最大读序长度取决于模板的二级结构、碱基组成、PCR产物质量和其他参数。
最佳化的Pyrosequencing
Pyrosequencing反应利用的是酶级连系统,简单且强有力,给出阳性或阴性结果,每种成份和参数已最佳化,以得到高度一致的结果,精确度为99%(Pyrosequencing PSQ 96 System)。
* 底物浓度已最佳化
* 选择了Apyrase的特异浓度,保证了所有的dNTP被降解,包括ATP和dATPS
* dNTP降解速率慢于掺入速率,有利于dNTP充分掺入
* ATP合成速率快于ATP水解速率,使的ATP浓度和光产生正比于掺入的dNTP数目
* 仔细控制的试剂,保证了足够的活性和质量
待测模扳制备
通过PCR技术将待测序列扩增,其中引物之一用生物素标记。加入STREPTAVIDIN包被的磁珠于扩增的DNA中,DNA分子通过引物的生物素和STREPTAVIDIN包被的磁珠形成复合体。DNA变性后,带生物素标记引物的单链在磁场中得到纯化,然后就可用于与测序引物退火,以便进行测序反应。
系统的优点
可靠的化学原理和强有力的检测机理使的该系统不需要胶、染料或特异标记,测序事件可以实时检测。
* 快速、高通量、重复性好—10分钟内分析96 个SNP或每小时处理500个样品或每六秒
处理一个SNP
* 简单—带有软件和为SNP分析特异设计的SNP试剂KIT的台式仪器
* 强有力—标准格式,标准操作程序,勿需胶或tags
* 灵活性—每个实验孔(test well)可以进行一个SNP或一个样品的分析
* 序列信息—PSQ 96 系统也能提供序列信息,确保所产生资料的高精确度和可靠性
PSQ 96系统如何工作
PSQ 96系统利用Pyrosequencing技术为每个SNP测定10个以上碱基
* 带有退火引物的单链DNA模扳放入PSQ 96孔板
* 酶混合物, 底物和核苷酸( PSQ 96 SNP Reagent Kit)放在PSQ 96 试剂舱(Reagent
Cartridge)
* PSQ 96孔板和试剂舱放在仪器中
* 含SNP位点的序列输入SNP Entry软件包.
* SNP Entry软件包自动建议核苷酸的分配顺序,以条形图(bar graphs)形式展示三个可
能的理论结果
* 运行中每个孔的测序过程实时展示,可以用所有的孔或选定的孔。通过从已经输入SNP
Entry软件包的SNP列表中选择,每个孔能安排分析一个独特的序列
* 运行结束后,用SNP软件评估资料,通过比较原始资料和理论数据,确定每个样品的基
因型
SNP软件AQ产品信息
* 在大量DNA样品中定量化等位基因频率
1. 自动计算等位基因频率
2. 统计计算
* 产生SNP序列数据库
* 预测SNP分析的理论结果
* 进行基因型分析
* 进行原始资料的质量评估
* 控制仪器
PSQ96系统产品信息
* 专用的96孔样品板
* 整合的试剂分配系统
* 整合的混合器桌
* 温度控制的反应舱
* 冷CCD摄像机
* 基于WINDOWS 2000的易学好用的软件
系统的不同用途配置相应的软件和试剂