利用试剂盒，自己制备siRNAs或者dsRNA[选购宝典]

　

　

利用试剂盒，自己制备siRNAs或者dsRNA     长片断的dsRNA可以在植物、原生动物、昆虫、线虫中引发基因沉默。要研究这些对象，自己制备长片断的dsRNA是很容易做到的：通过合适的质粒亚克隆——线性化——体外转录的方法，就可以自己合成dsRNA。目前已经有商品化合成dsRNA的试剂盒（例如NEB的HiScribe RNAi Transcription Kit,后文介绍）。但是在哺乳动物细胞中，超过30nt的dsRNAs则引起非特异基因沉默。实验表明，在哺乳动物细胞内引发特异的基因沉默最有效的siRNAs是有19个碱基互补，两边3’端各有2个碱基突出（通常是UU，但是目前不清楚UU对siRNAs的活性影响有多大） 的一对21-mer的dsRNAs。由于体外转录利用T7RNA聚合酶进行体外扩增的时候，通常要求序列的首2个碱基为GG或者GA以提高合成效率，但是这两个额外的碱基会大大降低siRNAs的活性，而且通常体外转录很难高效合成这么小的RNA（通常需在25nt以上），因而早先哺乳动物细胞的RNAi实验中用到的siRNAs是用化学方法合成的，方便，简洁，不受碱基的限制。     可是不管怎么说，化学合成RNA的费用是相当高的（一个碱基要将近400元），特别是在哺乳动物细胞中siRNAs的效率不一，一般一个基因需要设计3—5对siRNAs以确定最有效的，这样的费用就高了（就是6—10条siRNAs（每条21nt），一个基因通常花费不少于20000）。如果需要重复设计，在国内还有时间上的困扰。     现在，多个厂家推出了不同的试剂盒，一个试剂盒可以自行设计合成多个siRNAs,灵活性和可控性都明显提高，不失为一种经济的选择。 体外转录制备siRNA 1. Silencer™ siRNA Construction Kit——Lower Cost & Higher Potency siRNAs Ambion公司的这个试剂盒是建立在体外转录的基础上的，其专利的设计有效克服了前面提到的难题，原理非常简单：     首先合成两段29-mer的DNA作为模版（DNA合成的价格就便宜多了,即使是全球最著名的DNA合成供应商Operon，也就是7、8块钱一个碱基），包括8个与T7启动子引物3’端匹配的碱基（称为引导序列，leader sequence）和21个设计的siRNA序列。     将这两个模版和对应的T7启动子引物分别混合，引物末端和DNA模版褪火结合，用DNA聚合酶Klenow大片断补平成为双链DNA模版，分别用T7 RNA聚合酶进行体外转录，将产物混合形成dsRNA，新的双链RNA包含5’端单链的引导序列和中间互补的19个碱基序列以及3’端两个重复的U（UU）。     通过DNA酶降解模版，同时用单链专一的核酸酶消化5’的引导序列，由于RNase不能切开U碱基也不能切双链RNA，所以得到的产物就是我们需要的21-mer的双链siRNAs——有19个碱基互补，3’端各有2个U突出。     通过试剂盒提供的纯化小柱，去除引物、碱基盐和蛋白质等杂质，得到的就是可以立即转化用的siRNAs！     RNAi的作用是非常强大的，而siRNAs在哺乳动物细胞中的应用，毫无疑问是最引人瞩目的。找到好的siRNA，的确非常有效，但是要找到好的siRNA就要费一番功夫，多次尝试。采用Ambion的这个试剂盒，你可以节约更多的时间和精力尝试其他的siRNA，以便找到对你的目标基因最有效的一个。由于减少了非特异反应，越是有效的siRNA，实验结果的信噪比就越高。     整个实验需时不超过2天，但是却可以得到15个siRNAs，而且每个siRNAs的产量很高，足够做上百次转染实验。一个试剂盒提供足够的试剂生产15个纯化的双链siRNAs，可以直接用于转染。用这种方法的花费只是化学合成费用的一小部分—— 一个试剂盒价格人民币8349，还低于化学合成一条21-mer的siRNA的价格（按400元每个碱基计算，还未计算HPLC纯化的费用）。根据厂家提供的信息，这种方法合成的siRNA的效率要比用化学法合成的同序列的siRNA至少高20倍！估计原因是由于化学合成每一步的合成效率和纯化效率都不能到100%，20步反应后经过HPLC纯化后纯度才97%，因而对结果有影响。     需要进一步了解这个试剂盒的详细信息或者定购有关产品，可以直接点击以下连接——Silencer™ siRNA Construction Kit。     除了这个产品，当然还有不少其他厂家的产品，欢迎继续关注生物通技术专栏的相关文章。 相关文章 RNAi——回顾 RNAi研究相关的产品介绍之一 siRNAs的设计和设计工具 如何寻找siRNAs的目标靶位点。