有3900多个大鼠基因的Plastics Microarray和人类7600个基因的芯片[新品推荐]

【字体: 时间:2002年04月04日 来源:

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    cDNA芯片是大家熟悉的产品,最常见的制作方法是用PCR方法得到的cDNA点在相应的支持物上。但是由于不同的基因长短不同,Tm值各异,成千上万的基因在同一张芯片上杂交,使得杂交条件很难同一。同一个体中总是存在一些基因家族的同源序列,加上有的物种存在基因重叠序列(例如酵母的6000个基因中就有728个基因中都有101个碱基长的完全相同的序列)的相互干扰,使得传统的cDNA芯片的分辨能力受到限制,结果的准确性也受到影响。再加上PCR产物是结合稳定的DNA双链,加入探针后在杂交中必然存在竞争性抑制,影响探针和模板的结合能力和稳定性,进一步影响cDNA芯片的分辨能力和结果的可信度,这对于低丰度的基因影响尤为明显。PCR产物浓度不均一也可能导致错误的结论。所以有人说在国际上cDNA芯片已经过时了,在目前的技术水平下DNA芯片的代表应该是寡核苷酸芯片,即Oligo Chip。所谓的寡核苷酸芯片只不过是用合成的、一定长度的、基因特异序列的单链寡核苷酸代替PCR合成的全长cDNA双链,点在片基上,但是这一小小的改动却使寡核苷酸芯片比传统的cDNA芯片有了无可比拟的优点:

  • 序列经过优化,减少非特异杂交,能有效区分有同源序列的基因

  • 减少二级结构

  • 杂交温度均一,提高杂交效率

  • 合成产物浓度均一,避免因样品浓度差异而造成点样量差异

  • 无需扩增,防止扩增失败影响实验

    虽然到底多长的寡核苷酸是最适用于芯片杂交,不同的厂家有不同的看法,不过区别于基因芯片的领头羊Affymetrix公司原位合成技术,预合成的寡核苷酸点在片基上需要一定长度与片基结合,当寡核苷酸序列较短时,单一的序列不足以代表整个基因,需要用多段序列。全球最大也是最权威的DNA合成厂商Operon比较35-mer, 50-mer, 70-mer和90-mer之后得到70-mer是最佳长度的结论,因为70-mer寡核苷酸探针的设计可以得到足够的高的灵敏度,同时保持很高的基因特异性。而Clontech公司则选择80-mer寡核苷酸来制作Clontech的寡核苷酸芯片。

    Atlas Glass Microarrays是将Clontech公司经典的Atlas技术应用于玻片片基上的结果,是一种高质量、可信赖而又方便好用的DNA芯片。每张芯片的大小为75 x 25 x 1 mm。继原来的有3800个人类基因的Atlas Glass Human 3.8  Microarrays I和II后,Clontech公司将两者结合到一起,推出了有7600个基因的Atlas Glass Human 7.6 Microarray,这个芯片上有更全面的基因和更广阔的覆盖范围,提供更高的性价比、更经济的研究工具。每个试剂盒有4张芯片,每张芯片有7600个基因。

    新产品依然保持原有产品的优点:芯片上每一个基因是由一段80个碱基的"长寡核苷酸"单链组成,每一段"长寡核苷酸"序列都是经过Clontech专利的软件从对应的基因中挑选出来的一段,保证该段序列和GenBank中其他现有全部序列的同源性最低。这个技术不但减少了非特异杂交,提高检测的精确度,更使得区分多基因家族成员和基因的不同剪接形式成为可能,而这如果用完整的cDNA则是不可能做到的。均一长度的寡核苷酸使的数千个基因的杂交条件更为均一。由于固定在芯片上的单链DNA分子和单链cDNA探针在杂交时没有竞争性抑制(比如双链DNA),使检测的灵敏度更高,背景更低。特别值得一提的是Clontech公司对所有的"长寡核苷酸"序列进行检测以保证所有片断都能产生足够强的杂交信号。检测方法是合成各序列的反义片断,标记并与芯片杂交,将杂交信号很弱的序列重新设计直到确认每一片断都能产生强而专一的杂交信号,代表正确的基因。这是唯一一个进行这项测试的厂家。这项测试能排除25%-30%的杂交信号太弱而可能影响结果的序列。


   片基选用Clontech的DNA-Ready Type II Slide,这种玻片不但可以提供高效的核酸结合能力,同时也最大程度的防止点与点之间的交叉污染。

   除了4张芯片外,每一种Atlas Glass Microarray试剂盒都提供GlassHyb杂交液和和GlassHyb Wash Solution,以及用于合成cDNA探针的基因特异性引物CDS Primer Mixes,由于芯片上所有基因序列都是已知的,用对应的引物混合物制备的cDNA探针只含有芯片上有的那些基因的对应序列,不含有和芯片上的基因无关的序列,降低了探针的复杂性,这样就减少了非特异结合,提高了杂交的灵敏度。

    在合成cDNA探针时可以选择用荧光标记样品探针,这样就可以用不同的荧光染料标记不同的样品,从而使2个以上的样品可以同时和同一张芯片杂交,利用芯片扫描仪不同的波长来检测不同样品的信号,这样在样品之间的信号比较分析时可以避免不同的芯片上对应点之间Oligo的量的差异造成的影响,还可以节约成本。这个产品还允许用同位素标记(33P)并用磷屏成像系统来分析检测结果。

    每一种Atlas Glass Microarray试剂盒都提供易于使用的旋盖式玻片芯片专用杂交盒,较大的容积能减少非特异结合。用户可以根据研究方向的需要选择Human 3.8 I或者3.8 II,或者更为经济适用的7.6系列。还有配套的荧光标记试剂盒可供选择。


2. Clontech Atlas Plastic Rat4K Microarrays
    Atlas Plastic Rat4K Microarrays是包含有超过3900个大鼠基因的寡核苷酸芯片,其中超过1500个基因参与毒理反应,是研究毒理学的好工具。

     Clontech公司首创以胶片(Plastic film)作为支持物,将核酸按一定排列高密度点在胶片上,胶片的大小规格为8cm x12cm,比前面介绍的玻片要大的多。胶片结合了玻片片基和尼龙膜的许多优点:象尼龙膜一样允许在杂交后洗脱探针,同一张芯片可以反复杂交多次;同时又象玻片一样允许高密度点样(目前最多有8300个基因,每个基因都是并排双点),每个点都均匀一致而且分隔良好;由于胶片的表面不象尼龙膜那样多孔,大大减少了非特异吸附,杂交后无需洗涤多次就能够得到干净的背景,保证良好的信噪比;胶片有一定的刚性,在高温洗涤时也不会卷曲,多次洗脱探针—反复杂交也不会变形,不但易于操作而且便于扫描读数和结果分析。为了保证信号的可靠,胶片上的每个基因都是双点的。

    和前面的玻片一样,胶片上每一个基因是由一段80个碱基的"长寡核苷酸"单链组成,每一段"长寡核苷酸"序列都是经过Clontech专利的软件从对应的基因中挑选出来的一段,保证和其他基因最低同源性以减少非特异杂交,同时经过测试保证这些序列确实对应正确的基因并能得到强的杂交信号。另外由于不同批次的芯片上点样的核酸量会存在区别,Clontech从每一轮制备芯片的过程中选出9块芯片(开始、中间和最后各3块),用同一反义校准探针杂交,每一点的信号经采集比较得到校准因子,有关数据在网上公布,这样客户就可以参照这些数据对不同批次的芯片杂交结果进行比较。常用的探针标记方法可以是同位素标记,甚至化学发光标记。由于规格较大,所以不需要特殊的芯片扫描仪读片,只要常规的磷屏成像系统就可以读数分析结果了。每个Plastic Microarray除了2张芯片外还提供合成探针用的基因特异性引物和专用的杂交盒,以及刻有膜上所有基因名、位置、GenBank号等信息的光盘。

    由于可以反复杂交,每次反应的成本下降,而且操作简单,不需要特殊的芯片扫描仪,Clontech的Plastics microarray使高密度芯片不再是遥不可及的“高科技产品”,是每个实验室都用的起的,能显著改变研究进程的得力工具。除了大鼠芯片,值得推荐的还有早前推出的有8300个已知人类基因的Human 8K胶片芯片和含有5012个小鼠基因的Mouse 5K Plastics Microarray。还有配套的系列产品,包括用化学发光法代替同位素的检测试剂盒都有推出。

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