CyDye荧光标记常见技术问题[心得点评]

Q:有什么不同的标记技术能被用来制备CyDye标记的探针？
A: 有几种不同的路线可以用来制备荧光标记的探针，最常用的有：
1.cDNA第一链标记：是用反转录酶将CyDye标记核苷酸直接掺入到cDNA中。这是大多数用户的首选路线，存在的局限性是酶对于CyDye标记核苷酸的低掺入效率。(也就是能够被掺入和检测到的荧光分子数)。大多数酶不能均一地掺入Cy3和Cy5荧光素；因此杂交后产生的信号也通常是不均一的。Cy5的掺入效率通常不如Cy3高；然而，在CyScribe cDNA第一链标记试剂盒中的CyScript酶经过验证对两种Cy3-和Cy5-标记核苷酸都有高效掺入。
2. 合成后标记(Post labelling)：这一方法是将一个化学活性核苷酸类似物(氨基烯丙基-dUTP)在链合成中掺入到cDNA第一链中。该类似物与无修饰的核苷酸掺入效率相似，得到的探针随后用CyDye的活性反应物进行“合成后标记”，该活性反应物与修饰后的核苷酸结合。这一方法步骤更多并且需要纯化但是能得到Cy3和Cy5更加均一的掺入和更强的信号。CyScribe合成后标记试剂盒提供最简单的方法来进行合成后标记。

为什么信号强度非常重要？
强的信号能增加生物芯片分析得到的信息量。这是因为在细胞中的低拷贝数转录物能够得到有意义的数据。而这些多数是在生物过程中有调控功能的基因。

为什么获得相似的Cy3和Cy5杂交信号强度非常重要？
用生物芯片进行基因表达差异分析是基于在同一张玻片上两种不同mRNA种群之间的比较。重要的是要尽可能相同地制备两种探针来降低实验的假象；因此，CyDye的均一掺入是非常重要的。此外，不是所有生物芯片扫描仪都能同等地检测Cy3和Cy5。

为什么酶的选择如此重要？
CyScript有几个特点使它成为制备CyDye标记的cDNA探针的首选酶。它的cDNA得率非常高，而且有MMLV反转录酶的高效和可靠性。CyScript不仅用在CyScribe cDNA第一链标记试剂盒中使CyDye-核苷酸高效掺入cDNA中，还用在CyScribe合成后标记试剂盒，能够将氨基烯丙基dUTP 高效掺入cDNA中。CyScribe试剂盒提供CyScript酶最优化反应条件的缓冲液。

相对于cDNA第一链标记，合成后标记方法的优点是什么？
生物芯片标记是一个发展中的技术，探针制备的不同方法被不断开发出来。作为CyDye-标记核苷酸掺入的替换方法，合成后标记技术被普遍采用是因为：
* 用合成后标记方法的cDNA得率比用直接掺入高许多，在直接掺入中CyDye-标记核苷酸是一个限速因素。
* Cy3和Cy5活性荧光素的间接掺入比CyDye-标记核苷酸掺入更加高效和均一。
* 合成后标记方法有效降低由于CyDye-标记核苷酸大小引起的掺入假象(如链终止，邻近荧光淬灭，序列特异性误差)。
* 合成后标记得到较长cDNAs片段，这样对于芯片上来源于cDNA的5’末端的目的片段更加有效。

为什么我要试用CyScribe合成后标记试剂盒？
通过优化的试剂和方法，CyScribe合成后标记试剂盒是设计作为一个易于使用的合成后试剂盒，保证能得到出色的结果。特别是它包括特殊优化和琥珀色小管独立包装的，专为合成后标记设计的Cy3和Cy5两种活性反应荧光素。
CyScribe合成后标记试剂盒包含所有标记试剂，可以得到信号强并且均一的标记探针，还包括特有的生物芯片杂交缓冲液。

用 CyScribe合成后标记试剂盒提供的小份CyDye而不是在Amersham Biosciences BioDirectory上的单活性反应物CyDye的优点是什么？
在BioDirectory中列出的荧光素是为了相对大规模蛋白标记设计的；因此，每个小管至少包括足够几次cDNA标记的荧光素。额外的荧光素随后或者被扔掉，或者需要被溶解在有机溶剂中，冻干并以小份保存以备将来使用。然而，这些活性荧光素易于被潮湿空气降解----即使储存在盖子很紧密的管子中。测试显示当小份储存时活性基团的容量每天降低大约1%。这意味着这些小份的保存期限非常短。而在CyScribe合成后标记试剂盒中的CyDye小份包装是由锡箔密封加上干燥剂。最后，这一试剂盒中提供的活性CyDye经过测试是适合cDNA应用的，而在BioDirectory中列出的荧光素只做过蛋白标记测试。

如果我用一个新的标记试剂盒或者一种不同的标记方法，会得到不同的基因表达模式吗？
从mRNA制备cDNA探针意味着最终得到原始mRNA分子群的代表。标记方法能影响在探针中的mRNA序列的代表性。几个因素对此有影响：
1.不同酶对mRNA上的各种二级结构转录有其不同的固有能力。这样就可能在转录物的代表性上产生序列特异性偏差。
2.在标记反应中CyDye的量将影响每个cDNA分子有多少荧光素分子被掺入。这是序列依赖的并且将决定每个cDNA得到的信号强度。
3.在第一链合成反应中CyDye-标记核苷酸的存在可能会导致在转录中多聚核苷酸延长时的链终止。这将影响观察到的表达模式。
4.不同的引物起始方法将导致转录物有的不同代表性，由oligo(dT)起始通常偏向mRNA的3’末端，因此可能不会有5’序列的代表性。因为CyScribe合成后标记试剂盒以oligo(dT)和随机引物相结合来起始，它能更好的覆盖从3’到5’末端的mRNA序列。
不同标记方法可能因此而显示一些点的表达模式的变化。这是生物芯片技术的一个普遍性质：表达模式是一个由表达水平、探针长度(由mRNA长度决定)和荧光素在探针中的掺入等因素所组成的复合体。

由不同标记方法产生的基因表达模式的差异会在双色比较生物芯片分析中得到不同的结果吗？
不会，只要在同一玻片上分析的两种探针是用完全相同的标记方法制备的。两种标记方法可以被用来并行同时鉴别完全同一个差异表达模式，但是这两种标记方法不能被混合使用。得到更强信号的探针标记方法，如CyScribe合成后标记试剂盒所用的那样，可以给出额外的数据，因为低拷贝数转录物变得可被检测。

如果我在反应中用更多的CyDye能得到更强的信号吗？
在CyScribe合成后标记试剂盒中的反应条件已经经过优化，所以在每个标记反应中已经存在多余的活性CyDye。我们不推荐超过这一用量因为后续的探针的纯化将更困难。

我可以在不同标记样品间将活性CyDye分成小份吗？
我可以在活性CyDye被溶解于重碳酸盐缓冲液中以后储存吗？
活性CyDye的量已经经过优化以得到cDNA的最佳标记，如果少于这一用量，对标记效率将有不利的影响。活性CyDye易溶于水溶液中并且将在几个小时后失去它的活性。因此不推荐为了将来的实验用途而储存溶解的CyDye。

我可以用总RNA而非mRNA吗？
CyScribe合成后标记试剂盒应该可以用于总RNA，但是对于真核RNA您将只能用oligo(dT)引物起始方法。为了提高从总RNA得到cDNA的产率，对每个反应的oligo(dT)锚定引物有一个建议用量。我们目前正在优化用总RNA的方法。

除了推荐的AutoSeq G-50柱以外，我可以使用其它纯化方法吗？
可以使用其它纯化方法，只要能去除体系中所有游离CyDye荧光素而同时能够有效地保留荧光标记的单链cDNA。在我们的经验里，我们发现AutoSeq G-50纯化柱和Qiagen QiaQuick PCR纯化柱能给出最令人满意的结果。