用户名:

密 码:

测序 | miRNA | 表观遗传 | 蛋白研究 | 细胞研究 | 免疫学 | 转染 | PCR | qPCR | 核酸纯化 | 基因表达

您所在的位置:首页 > 新技术专栏

从PAGE胶/琼脂糖凝胶中回收蛋白质/RNA/DNA的新工具[新品推荐]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2006年04月13日 来源:生物通

摘要:

  

免费索取:

分享到:
  

编者按:其实这是2003年生物通的一篇老文章了,介绍的是一种方便回收PAGE胶中的蛋白或者核酸的方法,方法本身和电洗脱在原理上没有大的差别,巧就巧在设计上,避免了透析带的麻烦和对样品的浪费,使得原来令人头疼的工作变得容易多了。这些年来,生物通不断接到读者来信询问如何购买这产品,当时的记录就有100多封邮件。可是原来生产这产品的以色列厂家货期非常不稳定,作为最早引入这产品的国内最大的代理商之一的基因有限公司,询问下来总是无法确定货期。2006年4月:生物通最新发现,Merck旗下Novagen公司已经引进这个系列的产品,产品的性能和价格和原来都差不多。鉴于Merck Novagen品牌在中国大陆有着非常广阔市场和良好的知名度,现在要购买这个产品就不在是问题啦,具体技术参数请直接咨询Merck800免费电话呀!现在将这老文章踢上来,既是想告诉可能有需要用到这产品的读者,也顺便向过去曾经向生物通查询过这产品的读者们说声抱歉,由于机器故障,过去全部邮件记录都无法恢复,无法一一通知你们了,而且时间久远,你们怕也早就不再需要了。对不起。

 

    从琼脂糖凝胶中回收DNA在今天当然属于“小菜儿一碟”,市面上有无数的公司提供不同价格不同品质的产品,许多实验室也有自己的“私家秘方”。不过对于几十上百kb的大分子片断回收,或者是在PAGE胶中回收蛋白质、DNA或者是RNA,现有的试剂盒往往回收率低或者无法保证大片断的完整性,因而需要用电洗脱回收。在样品量小又要求回收率高的情况下,这一直都是一个头疼的难题。

    代表新一代透析技术的明星产品GeBAflex-tube就是一个特别简单好用的,从PAGE胶/琼脂糖凝胶中回收蛋白质/RNADNA的新工具。这个样子象eppendorf管,带有双层透析膜结构的GeBAflex-tube,可用于从各种凝胶介质中快速有效地回收蛋白质,RNADNA,或者是RNA-蛋白复合物、DNA-蛋白复合物、蛋白质-蛋白质复合物条带。GeBAflex-tube适用于各种凝胶介质各种的缓冲液系统,回收率高,步骤简单,快速方便,使电洗脱成为格外简单的工作。除此之外,GeBAflex-tube还可以用于小量样品的透析和浓缩,真正是一物多用,是实验室必备的实惠之选。其应用范围包括:

  • 从各种凝胶介质中快速高效地回收蛋白质,RNA,DNA,RNA-蛋白复合物、DNA-蛋白复合物、蛋白质-蛋白质复合物条带

  • MAILD MS质谱中蛋白质样品的制备

  • 各种大小分子的核酸纯化

  • 小量样品的透析(50ul-3000ul)

  • 小量样品的浓缩

  • 更换样品缓冲体系

应用一:从染色PAGE胶中回收蛋白质

特点和应用

  • 回收率高 蛋白回收率 >85%(选择SeeBand染色液)

  • 步骤简单,快速方便

  • 配合各种型号的电洗脱/电泳仪

  • 回收量:0.5ug-25ug

  • 纯化蛋白分子量范围:>3.5kDa

  • 无蛋白酶污染,即用型,无需清洗或消毒

  • 质谱分析多肽分子量,结构特征和多肽鉴定

  • HPLC分析进行多肽测序

  • 氨基酸分析

  • 多肽谱(Peptide mapping)

  • Purification mapping

  • 微量蛋白纯化

  • 纯化PAGE分离的蛋白条带用于免疫动物制备抗体

  • 等电聚焦电泳中蛋白回收,同时从蛋白质中去除两性电介质

格外简单的使用方法

    电泳后PAGE胶染色(染色液中高浓度的甲醇会导致蛋白固定在凝胶上而减低回收率。推荐使用SeeBand蛋白染色液,不会将蛋白固定在凝胶上因而回收率>85%),切割条带后放在湿润的GeBAflex-tube中并加满缓冲液,盖好,放在试剂盒提供的支持架上(如图),放入带有缓冲液的水平电泳槽中,使管子完全没入缓冲液中,管中的双层膜和电场方向垂直。

    打开电源(通常用100V—150V电压),直到蛋白质离开凝胶(这个时间根据胶的浓度和蛋白质的分子量大小来决定),最后反向接通电源60-120秒使蛋白质离开膜。

    打开管子,用加样枪反复吸打5次后吸出含有待回收蛋白质的缓冲液至一个eppendorf离心管,高速离心1分钟以除去可能残留的凝胶碎片。

    得到的含目的蛋白的溶液可以
1.根据需要直接使用
2.按照常规的方法进行浓缩
3.按照常规方法进行蛋白沉淀(参见下面)
4.选择同一公司提供的ProteoConN or ProteoConD kits来浓缩样品(参见后面介绍)
5.用GeBAflex-tube进行透析,更换缓冲液

三氯乙酸法蛋白沉淀

1. 加入等体积的20%TCA(试剂盒提供),和样品混匀,4度静置1小时。
2. 4度14000RPM离心30分钟,去上清
3.加入500ul冰冷的丙酮,-20度保温30分钟(过夜会提高得率)。4度高速离心30分钟。
4.干燥沉淀,用适当的溶液溶液重悬蛋白。

用于质谱(去除SDS)沉淀方案

1. 加入1/10体积的MS Buffer(试剂盒提供)混匀,室温静置15分钟(如700ul样品中加入70ulMS Buffer)
2. 加入1/2体积的20%TCA(试剂盒提供),4度静置1小时(例如770ul样品中加入385ulTCA)
3. 4度14000RPM离心30分钟,去上清
4. 加入500ul冰冷的丙酮混合,-20度静置30分钟(过夜有助于提高得率),4度高速离心30分钟
5. 沉淀干燥。如果用于质谱分析,用相应的缓冲液重悬沉淀并进行后继的稀释步骤 

10% SDS-polyacrylamide gel (29:1 polyacrylamide:bisacrylamide)在100V电压下不同分子量的蛋白至少需要的电洗脱时间

Protein

(kDa)

Time

(min)

Protein

(kDa)

Time

(min)

14

35-45

50

75-85

19-26

45-55

66

85-95

29

55-65

81

105-115

40

60-70

116

120-130

45

65-75

128

140-150

 

应用二:纯化回收SDS-PAGE胶蛋白条带,应用于基质辅助的激光解吸离子化质谱分析(MALDI-MS

    虽然SDS-PAGE是当今最为常用的分离检测和估算蛋白质分子量的手段,不过要精确测算蛋白质分子量,用MALDI-TOFMS进一步检测从胶中分离的完整蛋白无疑是更好的方法。将SDS-PAGEGeBAflex-tube以及MALDI-TOFMS结合起来是相当有前景,因为这提供了一种快速精确的研究蛋白质的方法,而且即便是难以分析的蛋白如疏水膜蛋白或者是高分子量蛋白也可以用这个方法进行分。GeBAflex-tube试剂盒提供的MS 缓冲液可以彻底清除SDS,得到高产而不含SDS的蛋白样品。

    纯化SDS-PAGE胶蛋白条带,应用于基质辅助的激光解吸离子化质谱分析(MALDI-MS)的过程和前面基本相似,得到含有目的蛋白的溶液后需要进行以下步骤处理。

1. 加入1/10体积的MS Buffer混匀,室温静置15分钟(如700ul样品中加入70ulMS Buffer)
2. 加入1/5体积的50%TCA,4度静置1小时(例如770ul样品中加入154ulTCA)
3. 4度14000RPM离心30分钟,去上清
4. 加入500ul冰冷的丙酮混合,-20度30分钟(过夜有助于提高得率)后在4度高速离心30分钟
5. 沉淀干燥。如果用于质谱分析,用相应的缓冲液重悬沉淀并进行后继的稀释步骤 

应用三:用GeBAflex-tube从各种凝胶介质中回收DNARNA

    琼脂糖电泳凝胶中回收DNA已经不是什么难题,不过在某些情况下需要回收特别大的片断,比如超过100kb的片断,现有的试剂盒得率较低而且不能保证片断的完整,这时需要用电洗脱的方法,或者是要回收在PAGE凝胶中的DNA/RNA片断,用GeBAflex-tube都不失为一种稳定可靠的方法。回收的方法和前面基本一致,最后得到的含有目的DNA/RNA的溶液,加入0.1体积的KAc(试剂盒提供)和等体积的异丙醇混合,-20度保温10分钟,4度高速离心30分钟,用70%冰冷的乙醇溶液洗涤沉淀,4度高速离心5分钟,干燥沉淀即可。这种方法制备的DNA/RNA纯度很高,基本不受分子量大小的限制,而且最终产物的浓度可以自行调节,更加方便后继实验的不同需要。

应用和特点:

1. 从琼脂糖凝胶或PAGE胶中回收DNA片断用于克隆或者测序
2. 从PAGE胶中回收寡核苷酸(>=15nt)用于PCR,引物延伸,克隆
3. 从PAGE胶中回收纯化体内转录的siRNA
4. 从PAGE胶中回收稀有的RNA进行结构分析,tRNA分析,剪接和其他实验
5. 从胶中回收RNA/DNA进行足迹分析(foot-printing analysis),复合物分析
6. 回收蛋白-DNA或者是蛋白-RNA复合物

应用四:小量样品的透析和浓缩

应用和特点:

  • 除去样品中的EB

  • 更换样品的Buffer

  • 去除样品中的尿素

  • 去除样品中的去污剂/其他可溶杂质

  • 回收率>97%

  • 无蛋白酶,RNase, DNase, PCR相关污染

  • 即用型无需预处理或者消毒

  • EDTA处理的超净滤膜,无硫,无重金属离子,无菌

        类似epppendorf管的GeBAflex-tube,带有双层滤膜设计,除了可以通过电洗脱从PAGE或者琼脂糖凝胶中回收大分子,还可以用于大分子样品的透析和浓缩,以及改变缓冲液体系。快速高效,而且回收率高,减少样品损失。

    这个操作更简单。经水湿润后,将样品加入管中盖好,套入试剂盒提供的漂浮架子,在指定的透析缓冲液中透析(用磁力搅拌器能帮助缩短透析时间)。根据样品的量和粘度选择不同的透析时间和根据需要更换透析缓冲液。当透析结束后,如果觉得样品在透析后体积偏大需要浓缩,可以将透析管置于桌面,由于管子的专利大面积双层滤膜设计,能够帮助快速蒸发液体而浓缩样品,同时能防止污染(用风扇能够帮助加快蒸发速度)。透明的管壁方便随时监控管内样品体积的变化。最后打开盖子即可吸出样品。由于透析和浓缩都在同一个管子中进行,有效的减少样品的损失,从而提高得率。

    GeBAflex-tube有两种不同大小:800ul管和3000ul管。800ul管可以一步处理50ul-800ul的样品,而3000ul管可以处理100ul -3000ul的样品,3000ul管同时提供两种盖子,只需要通过换盖子就可以将样品量调整到100ul -2000ul或者100ul -3000ul(实际上就是通过盖子减少管腔内体积)。GeBAflex-tube上样和取出样品的操作都特别简单。

        GeBAflex-tube的双层滤膜有3种不同的截留孔径,35006000-800012000 -14000。可以根据不同的需要选择不同的孔径。

        Gene Bio ApplicationGeBA)是来自以色列的生物技术公司,在美国多年的实验经验使得他们设计生产出一些方便实验,灵活多用的小产品,因而深受实验人员好评。除了这个GeBAflex-tubes,他们的非固定的PAGE蛋白电泳染色液和蛋白浓缩试剂盒也很有特色,生物通将陆续为您介绍其中的好产品。[2006年4月更新:由于这个来自以色列的厂家货期难于确定,生物通最新发现,Merck旗下Novagen公司已经引进这个系列的产品,产品的性能和价格和原来都差不多。鉴于Merck Novagen品牌在中国大陆有着非常广阔市场和良好的知名度,现在要购买这个产品就不在是问题啦,请直接咨询Merck800免费电话呀!]

我来说两句(0)

[Ctrl+Enter]

加载读者评论......

相关文章:

    加载相关文章......

今日文章:

    加载今日文章......
    加载中......
    加载中......

技术期刊

GE期刊 | 基因快讯

    加载中......
    加载中......

更多>>

技术大讲堂

分子 | 细胞 | 蛋白 | 其它

    加载中......
    加载中......
    加载中......
    加载中......

更多>>

特价专栏

    加载中......

更多>>

会展信息

    加载中......

更多>>

生物通首页 | 生物通首页 | 今日动态 | 生物通商城 | 人才市场 | 核心刊物 | 特价专栏 | 生物直通车 | 科研交流 | 正牌代理商 | 中国科学人 | 新技术专栏 | 技术讲座

版权所有 生物通

Copyright© 2000-2011 eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号