非典型肺炎病例标本中新型冠状病毒的分离与鉴定[创新技巧]

生物通 | 新技术专栏

【字体：大中小】 时间：2003年04月23日 来源：

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祝庆余秦鄂德王翠娥于曼司炳银范宝昌常国辉

彭文明杨保安姜涛李豫川邓永强刘洪甘永华

(军事医学科学院微生物流行病研究所北京 100071)

《中国生物工程杂志》第23卷第4期106-112页

〔摘要〕目的对非典型肺炎的病原体进行分离鉴定，为该病的诊断、预防和治疗提供依据。方法采用细胞培养和乳鼠接种法，从非典型肺炎病例标本中分离致病病原体，通过电镜形态学、血清学和动物致病性观察及RT-PCR扩增与部分基因序列分析，对分离的病原体进行鉴定。结果成功地从死亡病例尸解的肺组织标本和患者鼻咽拭子标本中采用细胞培养法分离出病原体。通过电镜在病变细胞及其培养上清中观察到大量冠状病毒样颗粒。免疫荧光染色检测非典型肺炎患者血清，表明分离的病毒与此次流行的非典型肺炎密切相关。分离的病毒可对乳鼠致病，并在发病乳鼠的肺组织标本中通过电镜同样观察到冠状病毒样颗粒。从非典型肺炎病例尸解肺组织、传代发病小鼠肺组织及分离物感染的细胞培养物中，通过RT-PCR可分别扩增出冠状病毒的cDNA片段，测序结果显示其核苷酸序列与已知冠状病毒的同源性在60％左右。结论从非典型肺炎病例标本中已成功分离出一种新的冠状病毒，它与此次流行的非典型肺炎密切相关，很可能是此次流行的非典型肺炎的主要病原体。

〔关键词〕非典型肺炎；病原体；冠状病毒；分离鉴定；序列分析

Isolation and identification of a novel coronavirus from patients with SARS

Zhu Qing-yu, Qin E-de, Wang Cui-E, Yu Man, Si Bing-yin, Fan Bao-Cang, Chang Guo-hui,

Peng Wen-ming, Yang Bao-an, Jiang Tao, Li yu-chuan, Deng yong-qiang, Liu Hong, Gan Yong-hua

Institute of Microbiology and Epidemiology, Beijing, China, 100071.

〔Abstract〕Objective To isolate and identify the microbial pathogen of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS ), thus to lay the foundation for the diagnosis, prevention and treatment of the SARS. Methods Cell Cultures and suckling mice were inoculated by the samples from patients with SARS and autoptical tissues. The isolates were identified by morphology, serology, animal experiment, and RT-PCR amplification and partial sequence analysis. The causative association between the isolates and SARS was determined. Results A possible pathogen of SARS was isolated from the lung tissue of autopsy sample and nasal/throat swabs of the patients with SARS. The isolated microbial agents could cause cytopathic effects on Vero-E6 cells and a large quantity of coronavirus-like particles could be observed in the infected cells and supernatants under transmission electron microcope (TEM). Twenty-three of 26 serum samples from patients with SARS were tested positive by immunofluorescence assay, while 31 of the control serum kept all negative, indicating that the isolated virus was clearly associated with current SARS epidemics. The isolated virus was pathogenic to suckling mice, and coronavirus-like particles could also be seen under TEM. cDNA fragments specific to coronavirus could be amplified by RT-PCR from lung tissues of died patients with SARS, lung tissues of infected mice and cell cultures infected by the isolates, and sequence analysis showed that the homology of the amplified cDNA fragments to the previously known coronaviruses was about 60-70%. Conclusion A coronavirus was isolated from the SARS patients. The isolated coronavirus was clearly associated with the current SARS epidemics, and was possibly the key causative agent of SARS. The isolated virus was possibly a noval coronavirus.

〔Key words〕Atypical pneumonia, Pathogen, Coronavirus, Isolation and Identification, Sequence analysis

这次流行的非典型肺炎是一种急性呼吸道传染病，国外称其为重症急性呼吸综合征（Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS），主要通过近距离空气飞沫和密切接触传播，起病急、传播快，病死率高达3.5％。目前涉及到世界近30个国家和地区，全球患者已达2270多例，且发病人数仍有不断增加的趋势^[1]。非典型肺炎病原的分离和确证，对于该病的临床诊断、治疗及预防至关重要。通过近几个月对非典型肺炎病原体的研究、分析，目前世界上相关实验室的研究目标已集中在副粘液病毒、衣原体样颗粒和冠状病毒等病原体上。本实验室围绕该病病原体的分离和鉴定开展了研究工作，已从广东和北京地区非典型肺炎病例的尸解肺组织和鼻咽拭子等标本中分离到冠状病毒。现将结果报告如下。

材料与方法

一、材料

1．标本：肺组织标本2份，分别来自广州地区和北京地区“非典型肺炎”死亡病例；鼻咽拭子标本，采自北京地区住院“非典型肺炎”患者。

2．细胞：Vero-E6、MDCK、Hep -2、Hela、BHK-21和LLC-MK-2等传代细胞系，均为本所细胞库保存的细胞株。

3．培养基： RPIM 1640、DMEM，Gibco/BRL公司产品；小牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司产品；青霉素、链霉素：为华北制药厂产品。

4．实验动物：BALB/C和昆明种小白鼠乳鼠：3－5日龄，均为本院实验动物中心繁殖供应。

5．RT-PCR和扩增产物纯化试剂、引物：用于RNA制备的RNeasy Mini Kit，购于QIAGEN公司；反转录酶SuperScript II，Taq DNA聚合酶购自Invitrogen公司；核酸凝胶回收试剂盒QIAquick Gel Extraction Kit购自QIAGEN公司。

引物由北京三博远志生物技术公司合成：2Bp：5’-TCA CA(CT) TT(AT) GGA TA(AG) TCC CA-3’和4Bm：5’-ACT CA(AG) (AT)T(AG) AAT (CT)T(AGTC) AAA TA(CT) GC-3’；CV1：5’-Cag AgC CAT gCC TAA CAT g-3’和CV2：5’-AAT gTT TAC gCA ggT Aag Cg-3’；及BLF+ 5’-TgA Tgg gAT ggg ACT ATC CTA AgT gTg A-3’，BLF- 5’-TTg CAT CAC CAC TAg TTg TgC CAC CAg gTT-3’。这三对引物所扩增的片段均位于冠状病毒属聚合酶基因的高保守区^[2，3]。

二、方法

1．标本处理：

病人组织标本：取尸解肺组织标本，在预冷的乳钵中研成匀浆，加入适量的病毒稀释液（含500μ/ml青霉素、500μ／ml链霉素的1640培养基，pH 7.0）， 3000rpm离心20min，取上清用于接种细胞培和动物。血液标本：病人血液凝块在预冷的乳钵中研磨成匀浆，加入适量的病毒稀释液，使之研磨成10-20％的悬液，2000rpm离心20min，上清液用于接种；鼻咽拭子标本：按1000u/ml青霉素、1000μg/ml链霉素加入标本中，4℃过夜，3000rpm离心30min，上清液用于接种。

2．病原体分离培养：

乳鼠接种法：选择健康的3－5日龄乳鼠，在无菌条件下，用0.25mL的微量注射器脑内接种，每份样品接种一窝（至少５只），每只乳鼠脑内接种0.02mL，或同时腹腔接种0.03mL/只。每日观测小鼠的发病情况，一般观察7－14天。观察期内若未出现乳鼠发病，将乳鼠解剖取脑、肺组织，研磨成１０％的组织悬液，接种乳鼠，连续盲传３代。

细胞培养法：将处理好的标本接种于长成单层细胞的10mL细胞培养瓶中，每份标本接种两瓶，37℃吸附１h，然后吸出标本液、加含有２％小牛血清的细胞维持液，置37℃CO2培养箱培养。每天观察细胞变化，连续观察10天。若不出现CPE进行盲传，连续盲传３代。

3．电镜形态观察

电镜负染色检查：收集分离病原体感染的Vero-E6细胞培养液，以6.1% 、pH 7.2的戊二醛固定液与培养液按1:1比例混合固定后，以3%磷钨酸溶液负染色，透射电镜观察。超微结构检查：取感染乳鼠肺组织、肺组织标本和尸解肺组织标本感染的Vero-E6细胞，用3.1%、 pH 7.2戊二醛固定，1/15mol·L, pH7.2磷酸盐等渗缓冲液洗涤3次，1%锇酸固定后，梯度乙醇脱水，Epon812包埋，常规超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双染色，透射电镜观察。

4．间接免疫荧光染色

分离物感染细胞片的制备：将培养成单层的VERO-E6细胞用Hank’s液洗一次，然后接种分离物细胞培养悬液，放37℃孵箱中吸附1h，加入细胞维持液，1 mL／瓶，放37℃继续培养。待细胞刚刚出现病变时，取感染细胞滴片，将滴好的玻片放37℃CO2孵箱中继续培养8h使细胞贴壁。取出玻片，放入0.005M pH7.2 PBS中漂洗，除去未贴壁的悬浮细胞，凉干。放入冷丙酮内，-20℃固定30min，凉干，-20℃密封保存备用。间接免疫荧光抗体染色方法：将病人血清标本1：10稀释后，56℃作用30min，然后再适当稀释后分别滴加到细胞抗原片上，置37℃湿盒中作用30min（若检测IgM抗体则作用90min），冲洗，PBS振荡洗3次，凉干。然后加羊抗人FITC标记荧光抗体，置37℃湿盒中作用30min，冲洗同前，凉干，在荧光显微镜下观察染色结果。

5．RT-PCR扩增

待检标本中总RNA的制备，按RNeasy Mini Kit试剂盒说明书，由非典型肺炎患者的尸解肺组织、感染小鼠肺组织及其肝脾等脏器混合物，以及鼻咽拭子接种的Vero E-6细胞及其培养上清中提取总RNA。

首先进行反转录，在管中加入5μL总RNA，1μL Superscript II反转录酶（200u），1μL 引物4Bm2（或CV2,3），4μl 5×反应缓冲液，1μL RNA酶抑制剂和1μL10mM dNTP以及2μL 0.1M DTT，最后用不含RNase的水补足体积至20μL。于42℃反应60min后，95℃灭活5min。然后进行PCR扩增，反应系统包括：5μl 10×PCR反应缓冲液，1μL10mM dNTP，2μL25mM MgCl2，1μL TaqDNA聚合酶（2.5u），上下游引物各1μL（10μM），用水补足至50μL。用2Bp／4Bm、CV1／CV2和BLF+／BLF-引物对分别扩增40和35个循环。反应完毕，将产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。

6．序列测定、同源性比较和进化树分析：

将RT-PCR产物纯化后，由军事医学科学院生物工程研究所中心仪器室测序；也可将纯化的片段克隆至T-easy 载体，筛选阳性克隆测序。所测序列进行Blast同源性比较，根据Genbank登记的目前已知冠状病毒基因序列，使用DNAstar软件的MegAlign模块，采用Jotun Hein法进行多株冠状病毒相应序列比较并绘制系统发生树。

结果

一、病原体分离培养

细胞培养分离：选择了Vero-E6、MDCK、Hep-2 、Hela 和BHK-21等5株传代细胞株接种病例标本，进行非典型肺炎病原体分离。利用Vero-E6、MDCK细胞分别从广州地区和北京地区尸解的肺组织及北京地区采集的鼻咽拭子标本中分离出病原体（表1）。标本接种Vero-E6细胞培养后3天出现明显的细胞病变(CPE)（图1），并且能够稳定传代，稳定传7代的分离物已作为毒种保存。在MDCK细胞上也观察到了明显的CPE，但出现的时间较晚，需要5天。用另外3株细胞没能分离出病原体。另外，我们还用Vero-E6分离的病原体接种LLC-MK-2 细胞，在LLC-MK-2 细胞上分离的病原体也能生长，但出现CPE的时间要到接种后7天。